[发明专利]一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法。本发明首先通过实验证明接合转移法并不合适一株类球红细菌辅酶Q₁₀的高产菌株，而电转化方法适用于此高产菌株。通过实验结果表明：本发明的电转化方法不仅适用于该高产菌株，对其他类球红细菌的野生型菌株也同样有效。并以此方法出发，构建了多株过表达重组菌株，证实了此法的有效性和可重复性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法。

背景技术

类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是一类球形的革兰氏阴性菌，可天然合成具抗氧化功能的醌类物质辅酶Q₁₀。为了进一步提高辅酶Q₁₀的产量，非常有必要通过分子改造的手段优化辅酶Q₁₀的合成途径。

目前，研究者主要应用双亲接合转移的方法对类球红细菌野生型菌株进行遗传操作，但是双亲接合转移法并不适用于所有类球红细菌菌株。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种类球红细菌的转化方法。

本发明提供的类球红细菌的转化方法包括如下步骤：

(1)将类球红细菌接种于培养基中进行培养，收集菌体；将所述菌体依次进行洗涤和重悬后，得到类球红细菌感受态细胞；

所述类球红细菌感受态细胞的OD值为7.7-9.3；

(2)将外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞混合，得到细胞混合物，将所述细胞混合物进行电击转化，得到重组菌。

在本发明的具体实施例中，所述类球红细菌感受态细胞的OD值为8.0。

上述方法中，所述外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞的配比为1ng：(0.75-1.50)μL。在本发明的具体实施例中，所述外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞的配比为1ng：1.50μL；所述外源质粒为重组质粒pBBR1MCSK-idi或pBBR1MCSK-rs4253；

所述重组质粒pBBR1MCSK-idi为将pBBR1MCS载体中的氯霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因，且将序列1所示的DNA片段插入pBBR1MCS载体的KpnI和SacI多克隆位点间得到的质粒，其中，序列1所示的DNA片段依次由启动子、RBS、类球红细菌idi基因和终止子组成，类球红细菌idi基因为序列1第298-831位；

所述重组质粒pBBR1MCSK-rs4253为将pBBR1MCS载体中的氯霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因，且将序列2所示的DNA片段插入pBBR1MCS载体的KpnI和SacI多克隆位点间得到的质粒，其中，序列2所示的DNA片段依次由启动子、RBS、rs4253基因和终止子组成，rs4253基因为序列2第293-1492位。

上述方法中，所述培养的方法为将类球红细菌株接种于培养基中培养至OD值为0.58-0.70。在本发明的具体实施例中，所述培养的方法包括如下步骤：

1)从平板上挑取一个类球红细菌株JDW-610的菌落至5mL新鲜PYG培养基中，在32℃，220rpm摇箱中培养，直至对数生长期；

2)以适当比例转接对数期的菌液至10mL新鲜PYG培养基中，接种后OD值约为0.1；

3)在32℃，220rpm摇箱中过夜培养，直至OD值达到0.60。

上述方法中，所述电击转化的电压为(0.8-1.8)kV，具体为0.8kV、0.9kV、1.0kV、1.1kV、1.2kV、1.25kV、1.3kV、1.4kV、1.5kV、1.6kV、1.7kV和1.8kV；所述电击转化的时间为5ms。