[发明专利]区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法

说明书

本发明公开了一种区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，该方法以PRRSV NSP2基因组为模板，针对N1、N2基因序列设计特异性引物，构建重组表达质粒PET‑32a‑N1N2；在重组菌E.coliBL21(DE3)中成功诱导表达，利用His柱层析纯化，得到纯度较高的融合蛋白；利用纯化的PET‑32a‑N1N2蛋白，建立可用于区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法。本发明的方法特异性强、稳定性高、快速便捷，为猪蓝耳病免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了一种新的检测方法。

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及一种区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种急性传染病，临床主要特征为流产、产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难等，在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。本病于1996年在我国首次报道。

2006年我国南方部分省份出现养猪场暴发猪“高热病”疫情，发病猪以“高热”、“高发病率”和“高死亡率”为主要特征，给我国的养猪业造成了较大的经济损失。中国动物疫病预防控制中心田克恭等研究发现，猪“高热病”的主要致病病原为Nsp2缺失30个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异引起，后将其命名为“高致病性猪蓝耳病”(Highly PathogenicPorcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)，其致病性大大增加，仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡。依据猪繁殖与呼吸综合征病毒结构基因序列的不同可以将其分为欧洲型和美洲型两种基因型，而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒分为经典猪蓝耳病病毒和高致病性猪蓝耳病病毒两种亚型，高致病性猪蓝耳病病毒包括高致病性猪蓝耳病病毒江西株(JXA1-R株)、高致病性猪蓝耳病病毒湖南株(HuN4-F112株)、高致病性猪蓝耳病病毒天津株(TJ株)。目前我国使用的高致病性猪蓝耳病活疫苗有江西株(JXA1-R株)和湖南株(HuN4-F112株)、天津株(TJ株)。疫苗的使用需要配备适合的检测试剂盒才能进行免疫效果评估。本研究关于猪蓝耳病NSP2片段部分蛋白的制备，可运用于猪蓝耳病间接ELISA抗体的检测；建立了间接ELISA的方法来检测猪蓝耳病毒抗体，为猪蓝耳病免疫监测提供了技术平台。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简便、特异性好的能够区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，为蓝耳病免疫监测和流行病学研究提供技术平台，对PRRS 的防控有着重要的意义。

本发明所采用的技术方案如下：

1、引物设计

本发明根据GenBank已发表的PRRSV NSP2基因序列，设计一对克隆引物(N1、N2)，见表1，扩增包含PRRSV-NSP2-N1N2基因的序列，大小为332bp，见表1，并插入SalⅠ和BamH Ⅰ两个酶切位点。

表1扩增PRRSV-NSP2-N1N2基因的引物核苷酸序列

表1中，下划线部分为SalⅠ和BamHⅠ双酶切的酶切位点

2、目的基因的扩增和重组表达质粒的构建

通过特异性引物扩增克隆PRRSV NSP2基因部分片段(N1N2)，构建重组表达质粒PET-32a-N1N2，见图4。

3、目的蛋白的表达和纯化