[发明专利]一种偶数DNA分子量标准及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程研究与应用领域。具体地说，涉及一种200bp ladder DNA分子量标准制备用载体组合及其在制备200bp ladder DNA分子量标准中的应用。

背景技术

DNA分子量标准是指一组分子量已知的DNA分子的混合物，电泳后按照其分子量的大小和迁移率的不同，在电泳凝胶（琼脂糖凝胶或PAGE凝胶）上形成一个DNA片段分布的梯度 (ladder)，用以指示电泳过程中未知DNA样品的分子量。目前，各种规格的DNA分子量标准多由专业的生物技术公司专门生产。国内市场上的DNA分子量标准从最初的以进口产品为主、到目前以国产产品为主和许多自制品的出现，制备和生产DNA分子量标准的方法为越来越多的人所掌握。DNA分子量标准的生产主要涉及DNA样本的酶切消化产生较大的DNA分子和PCR扩增制备较小的DNA分子；其中限制性内切酶酶切的DNA分子的来源又可以分为天然的基因组DNA 和人工构建的质粒载体；PCR扩增又可分为单片段的扩增和多片段的扩增。

1. 通过限制性核酸内切酶酶切制备DNA分子量标准

利用DNA分子中存在的限制性内切酶酶切位点（天然的或人为加入的），采用合适的内切酶对其进行消化，从而形成一组分子量各异的DNA片段，用来作为DNA分子量标准。按照被消化DNA的来源可以分为两种：天然来源的特种DNA（如基因组）和人工构建的质粒DNA。天然来源的基因组DNA的限制性内切酶酶切是通过分离某种来源的基因组DNA分子，然后用一种或几种限制性内切酶进行消化，从而产生一系列的DNA片段组合，目前最常见的此类DNA分子是 Lamda噬菌体的基因组DNA（λDNA），由其产生的DNA分子量标准有λDNA/HindIII， λDNA/EcoRI+HindIII 等，也可以是某种具有多个常见酶切位点质粒，如pBR322 DNA/AluI marker和pBR322 DNA/BsuRI (HaeIII) marker，但是所用的内切酶都是不常用的，因而成本较高。人工构建载体(质粒)的限制性内切酶酶切是通过一次性把所需要的各种DNA片段克隆到高拷贝数的载体上，转入大肠杆菌，通过发酵培养和质粒DNA的分离纯化，经过适当的酶切即可以获得大量的目标DNA片段。这种方法的优势在于通过大肠杆菌的发酵扩增质粒获得目的DNA片段，其制备规模很容易放大（50升的发酵体系很容易建立，而PCR扩增一般只能在小于500微升的体系内进行），获得的DNA片段条带在凝胶上条带锐利，过程重复性高。不存在PCR扩增再现性不好的缺点。而且由于质粒是一种遗传单位具有生命的基本特性即无限繁殖（扩增），所以这种质粒一旦构建好，即可以无限应用，不存在再生的问题。因而具有很大的应用空间。

2. 通过PCR扩增制备DNA分子量标准

由于PCR（Polymerase Chain Reaction）技术强大的DNA片段的扩增能力，同时由于目前Taq DNA聚合酶工程菌株的广为流传，目前利用PCR方法生产DNA分子量标准不存在技术问题，成本主要是引物合成和dNTP的购置，其他PCR试剂如TaqDNA聚合酶，模板DNA，反应Buffer等均可自制。由于生产效率低， 浓度强度高， 因而限制了其大规模的制备和应用。

在DNA分子量标准制备研究方面，我国科研工作者进行了较为系统的研究， 如叶春江等人构建了多个具有实际应用价值的DNA 重组载体，通过酶切可以产生多种具有核酸分子量参考意义的DNA片段组合(Ye Chunjiang. Electrophoresis, 2010, 31:2929–2935; Wu Jianbing Mol Biol Rep. 2011, 38(4): 2729–2731; Zhe Chen Mol. Biotechnol. 2009, 42(1): 128-133; Huang Dongyi. Plant Molecular Biology Reporter 2008 26(4):316-323; 张颖. 中国生物工程杂志.2009, 29 (8) : 119-123)。

长期以来，分子生物学试剂与基因工程研究领域，特别是核酸电泳领域，对于200bp DNA ladder 的制备缺少一种简单高效的方法。普遍存在技术水平低，简单重复工作为主的DNA marker制备方法。从而使得目前该种类型的DNA marker 价格居高不下，既造成了巨大的人力、原料浪费， 同时对广大科研工作者造成了一定的影响。

发明内容