[发明专利]检测ADAMTS13基因全外显子的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测ADAMTS13基因全外显子突变的试剂盒和方法。

背景技术

1924年，Eli Moschcowitz最初详述了血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenicpurpura，TTP)，其在临床上主要表现为典型的三联征:即血小板减少，微血管病性溶血性贫血，神经系统损伤；若同时伴有肾脏损害及发热，则形成TTP经典的“五联征”。1997年，慢性复发性TTP患者缓解期血浆中的超大分子量vWF多聚体与vWF裂解酶的缺失之间的联系正式确立。此后，研究者们将这种水解蛋白酶纯化，对先天性TTP家族成员进行了全基因组连锁分析。ADAMTS13基因位于9q34，长度为37kb，包含29个外显子。Zheng等首次对ADAMTS13进行了克隆，并将其列为ADAMTS家族的新成员，称为ADAMTS13。先天性TTP的发病率小于5％，由于严重的ADAMTS13缺乏所致，与ADAMTS13基因突变有关。

现已报道的ADAMTS13突变已经超过140种，包括错义突变、小片段缺失和插入、无义突变以及结合点突变等等。ADAMTS13的基因突变波及整个ADAMTS13蛋白，主要是降低其分泌和(或)酶活性。获得性TTP80％的TTP患者属于获得性TTP，通常由于循环ADAMTS13自身抗体所致。这些抗体能够抑制ADAMTS13蛋白的活性，但是也有10％－15％的患者体内没有抑制性抗体，而是由于增加了抗体调节的ADAMTS13清除率导致ADAMTS13活性严重减低所致。

直接突变检测通过DNA测序仪对ADAMTS13基因直接测序，找出突变的确切位置，可提供更为准确的信息。由于实现了自动化操作，我们采用的PCR结合DNA直接测序方法，因而大大缩短了诊断时间，节省了的人力和物力，测序效率高，能够确定基因突变的位置和形式，结果也更为明确。

多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等方法,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于ADAMTS13容量大、突变类型多、突变位点散在分布,故而阻止了对ADAMTS13基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。

本发明采用Sanger测序法检测ADAMTS13基因全外显子序列的突变，并且设计的引物可以扩展全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解ADAMTS13基因全外显子的基因突变情况，并不受ADAMTS13的基因突变多样化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。

发明内容

本发明提供检测ADAMTS13基因全外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测ADAMTS13基因全外显子突变的情况，用于TTP的基因诊断。

本发明的目的在于提供检测ADAMTS13基因全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测ADAMTS13基因全外显子突变的26对正、反向引物；其碱基序列为：

进一步地，引物序列ADAMTS13-1F、ADAMTS13-1R是扩增ADAMTS13基因第1号外显子序列的引物，引物序列ADAMTS13-2F、ADAMTS13-3R是扩增ADAMTS13基因第2号外显子序列的引物，引物序列ADAMTS13-5-6F、ADAMTS13-5-6R是扩增ADAMTS13基因第5和6号外显子序列的引物，以此类推，引物序列ADAMTS13-17-18F、ADAMTS13-17-18R是扩增ADAMTS13基因第17和18号外显子序列的引物，引物序列ADAMTS13-29F、ADAMTS13-29R是扩增ADAMTS13基因第29号外显子序列的引物。

进一步地，所述26对正、反向引物的使用浓度为1:1；

本发明的目的还在于提供一种检测ADAMTS13基因全外显子的方法，其包括如下步骤：

(1)提取样品DNA；