[发明专利]一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物、方法及试剂盒

权利要求书

1.一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

正向引物F: GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

反向引物R: ACTATAAAGAAGATTATTACAAAGGC。

2.一种一次性检测多种肉源性成分的检测试剂盒，包括PCR反应液、Ex-Taq DNA聚合酶、裂解缓冲液、TE缓冲液、苯酚和检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

正向引物F: GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

反向引物R: ACTATAAAGAAGATTATTACAAAGGC

所述的裂解缓冲液为10mmol/L pH8.0的Tris-HCl，0.1mol/L pH8.0的EDTA和质量体积比（m/V）为0.5%的SDS；

所述的TE缓冲液为100mmol/L pH8.0的Tris-HCl和10mmol/L pH8.0的EDTA；

所述的苯酚为经0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl平衡到pH值为8.0。

3.一种一次性检测多种肉源性成分的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、采用蛋白酶K-苯酚法提取肉类样品的基因组DNA，具体为：将肉类样品研磨成肉糜，加入裂解缓冲液，每200μL的裂解缓冲液对应加20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，水浴，再加入等体积的经0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl平衡的苯酚，其pH值平衡到8.0，离心分离两相，转移水相再用苯酚抽提两次，收集水相再次用苯酚抽提第三次，转移水相加入醋酸铵及乙醇，离心收集DNA沉淀，70%酒精洗涤离心，加入TE缓冲液溶解产物，得到样品的基因组DNA提取液；

（2）、使用权利要求2所述的一次性检测多种肉源性成分的检测试剂盒对基因组DNA进行PCR扩增，得到目的扩增片段；

（3）、采用二代测序方法对上述目的扩增片段进行测序以明确样品中含有哪些肉源性成分。

4.根据权利要求3所述的一次性检测多种肉源性成分的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其扩增反应体系为：每50μL的反应体系中含有10 × PCR Buffer 5 μL、20 nmol/μL 正向引物1 μL、20 nmol/μL反向引物1 μL、2.5mM dNTP 2 μL、5 U/μL Ex-Taq 1 μL、50ng/μL模板DNA 5 μL，并最终用双蒸水定容到50 μL；其扩增反应程序为：94 ℃变性3 min，98 ℃、10 s；48 ℃、30 s；68 ℃、1 min；30 个循环，68 ℃延伸7 min。

5.根据权利要求3所述的一次性检测多种肉源性成分的检测方法，其特征在于，所述的二代测序，为先测定各样品PCR产物的目的DNA片段的浓度，对于检测合格的样品构建文库，再用合格的文库进行cluster制备和高通量测序；测序采用Illumina HiSeq4000平台和PE150bp的测序策略，以及Q2085%策略对测序的准确性进行控制；测序后对原始数据进行过滤处理，过滤低质量的reads，剩余高质量的序列用于后期分析；由原始序列数和有效序列数得出序列的有效利用率，以判断测序质量和DNA提取的效果，再做后续的序列聚类和注释；把97%相似度的有效序列聚成同一个操作分类单元，然后通过操作分类单元与数据库比对进行序列的物种注释；注释后，省去与库中参考序列低于98%相似度的序列，以保证序列物种注释的准确性。