[发明专利]一种花生焦斑病菌分子检测引物及其快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种花生焦斑病菌分子检测引物及其快速检测方法，属于农作物病害检测和生物技术领域。

背景技术

花生是世界范围内广泛栽培和种植的经济作物，是发展中国家重要的食用植物油脂的蛋白质来源。我国花生种植面积居世界第2位，年总产一直稳居世界第1位，花生油也是我国主要的食用植物油。近年来，随着我国高产花生品种的推广、农业产业结构调整和丰产栽培措施的应用，花生病害日趋严重，已成为限制花生生产的重要影响因素之一。

花生焦斑病（Leptosphaerulina crassiasca）是花生上广泛纯在的一种病害，在很多国家都有发生。该病主要为害花生叶片，也为害花生叶柄、茎、果柄和荚果，在叶片上通常产生焦斑和胡麻斑两种类型的症状，其中焦斑症状最为常见，通常发生在叶尖和叶缘。病斑扩展的边缘有一明亮的黄带，坏死组织变成暗褐色，病斑常呈现楔形、半圆形和不规则形，在叶片中部发病病斑多呈圆形或近圆形或不规则的褐色病斑。花生发病后叶片早衰、早落，严重影响光合效能，造成荚果不饱满，重者整株枯死，导致产量和品质下降。该病在田间的病株率一般在30%以上，严重可达100%，该病害的病还症状与花生褐斑病、花生炭疽病相似，没有专业知识难以判断区分。

以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差，难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行，难以满足花生焦斑病诊断的实际需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度高的快速诊断技术。近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，其中PCR（polymerase chain reaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断。真菌核糖体转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计特异性引物进行PCR，对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用，国内外研究人员已成功开发出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘溃疡病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方锈病菌等多种病原菌的特异性引物和检测方法，实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关花生焦斑病菌分子检测的研究尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中对花生焦斑病菌的检测和鉴定主要基于病原形态学特征，程序繁琐、耗死长、对鉴定经验要求高、准确度低，难以满足花生焦斑病诊断的实际需要问题，提供了一种花生焦斑病菌分子检测引物及其快速检测方法。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明首先提供了一种花生焦斑病菌分子检测引物，其核苷酸序列为：

上游引物LCSF：5’-GAGATGTACTGCGCTCCGAA-3’；

下游引物LCSR：5’-ACTTACGTTTCCTCGGCGG-3’。

所述引物LCSF和LCSR对花生焦斑病菌特异性扩增出355bp的产物。

本发明还提供了一种花生焦斑病菌的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)从花生植株中提取DNA；

用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA；用于检测花生植株组织是否存在花生焦斑病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取花生植株组织基因组DNA。

(2) 以提取花生植株DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的LCSF和LCSR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，57℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出355bp的产物，则可判定所述病菌为花生焦斑病菌或所述花生植株中存在花生焦斑病菌，否则所述病菌非花生焦斑病菌或所述的花生植株中不存在花生焦斑病菌。

本发明的积极有益效果在于：