[发明专利]一株发酵生产(3R)-乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一株发酵生产(3R)‑乙偶姻的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DL11‑11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13141。利用枯草芽孢杆菌DL11‑11发酵生产高纯度(3R)‑乙偶姻，以葡萄糖为碳源，可产63.8g/L的(3R)‑乙偶姻，(3R)‑乙偶姻的纯度可达到96.5％，发酵过程中乙偶姻总浓度可达78.7g/L。本发明菌株DL11‑11具有很高的合成(3R)‑乙偶姻的能力，同时乙偶姻的还原态副产物2,3‑丁二醇的产量很低，且供氧需求远低于大部分枯草芽孢杆菌，降低了设备需求，减少了分离提取的成本，具有良好的产业化优势。

技术领域

本领域属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及一株发酵生产(3R)-乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

乙偶姻(Acetoin)，又名3-羟基-2-丁酮(3-Hydroxybutanone)，是一种重要的天然香料，在白酒、蜂蜜、草莓、黄油等物质中都存在。由于手性碳原子的存在，乙偶姻具有两种立体异构体，(3R)-乙偶姻和(3S)-乙偶姻。单一的乙偶姻异构体在不对称合成领域具有广泛用途，可作为药物合成的中间体，也可用于合成具有光学活性的α-羟基酮类衍生物。

乙偶姻的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。根据国标的规定，化学法合成得到的乙偶姻为合成香料，微生物发酵法获得的乙偶姻属于天然香料，二者的市场价格存在巨大差距。而且，化学合成的乙偶姻为外消旋混合物，而微生物发酵法可以获得以某一异构体为主的产物，所以近年来微生物发酵法生产乙偶姻的研究颇受关注。

自然界可产乙偶姻的微生物很多，其中产量较高且生物安全的菌种主要有芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌。总所周知，天然菌株具有遗传性能稳定的特点，工业上用的菌种大部分都是天然菌种或是自然突变筛选得到的菌种。因此，近年来发酵法生产乙偶姻的研究主要集中于天然菌株的筛选及其改造，目标以提高乙偶姻总产量为主，而单一构型乙偶姻的生产研究较少。以葡萄糖为碳源，利用生物安全的天然菌株或基因工程改造菌株发酵乙偶姻时高产菌株的乙偶姻产量通常在70g/L以上。例如，B.amyloliquefaciens E-11发酵可产71.5g/L乙偶姻，生产强度1.63g/(L·h)(Process Biochem.2014,49：1223–1230)；2,3-丁二醇脱氢酶过表达的B.subtilis JNA3-10发酵可产73.6g/L乙偶姻，生产强度为0.77g/(L·h)(PLoS ONE 2014,9(3):e91187)。但是所述菌株生产的乙偶姻为两种构型的混合物，目前还没有能够发酵生产高纯度、高含量单一构型乙偶姻的天然菌株。

在单一构型乙偶姻的生产方面，已有一些基因改造菌或人工构建的大肠杆菌基因工程菌发酵的相关专利，例如CN 101565685 B、CN 102296094 B、CN 103388009 B。这些菌生产的单一构型的乙偶姻浓度不高，普遍低于40g/L。2015年Xu等发文报道了一株人工构建的大肠杆菌基因工程菌，将来自Serratia marcescens的budRAB基因和Lactobacillusbrevis的NADH氧化酶基因导入大肠杆菌，(3R)-乙偶姻的最高浓度为60.3g/L，立体异构体纯度为97.3％(J.Chem.Technol.Biotechnol.2015,90:93–100)，但这些菌株均为基因工程菌，存在遗传性不稳定的缺点。

综上所述，目前缺少产单一构型乙偶姻的天然菌株，获得产高浓度、高立体异构体纯度的乙偶姻的天然生物安全菌株对于工业化生产具有重要意义。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株高产(3R)-乙偶姻的天然菌株。