[发明专利]原核苯丙氨酸解氨酶变异体的组合物以及利用其组合物的方法

权利要求书

1.一种用于纯化具有最小聚集的多变鱼腥藻苯丙氨酸解氨酶(AvPAL)变异体的方法，该方法包括：

(a)通过均化作用对包含该AvPAL变异体的细菌细胞进行裂解，以生成细胞裂解物；

(b)加热该细胞裂解物至65℃达30至120min；

(c)将加热的细胞裂解物离心，其中保留包括该AvPAL变异体的上清液；

(d)将该上清液过滤，以去除沉淀物；和

(e)通过在阴离子交换(AIEX)柱，然后在疏水作用(HIC)柱上进行的依序色谱法从污染蛋白质中分离该AvPAL变异体，其中来自该HIC柱的洗出液包括该AvPAL变异体；

其中所述AvPAL变异体具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是一种用于纯化具有最小聚集的聚乙二醇化的多变鱼腥藻苯丙氨酸解氨酶(AvPAL)变异体的方法，该方法进一步包括：

(f)对所述来自该HIC柱的包括该AvPAL变异体的洗出液进行超滤、或者超滤和渗滤；

(g)通过将聚乙二醇与该AvPAL变异体混合对该AvPAL变异体进行聚乙二醇化；

(h)通过超滤和渗滤从该聚乙二醇化的AvPAL变异体中去除游离的聚乙二醇；以及

(i)配制该聚乙二醇化的AvPAL变异体,

其中所述AvPAL变异体被连接到聚乙二醇。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(i)的制剂中AvPAL变异体和聚乙二醇的比率为1:3。

4.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括冷冻和融化步骤(e)中获得的所述来自该HIC柱的包括该AvPAL变异体的洗出液，其中在冷冻之前向该HIC柱洗出液添加一种或者多种选自如下的多元醇或者糖：甘油、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和山梨醇。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述多元醇是甘油。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述甘油的浓度是10％(v/v)。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述糖是蔗糖。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述蔗糖的浓度是10％(v/v)。

9.根据权利要求4所述的方法，其中以离散温度步骤来冷冻或融化所述来自该HIC柱的包括该AvPAL变异体的洗出液。

10.根据权利要求4所述的方法，其中以离散温度步骤来冷冻和融化所述来自该HIC柱的包括该AvPAL变异体的洗出液。

11.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(f)中的渗滤缓冲液包括磷酸钾(KPi)以及一种或者多种由反式肉桂酸(t-CA)和甘油组成的药剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述渗滤缓冲液包括50mM Kpi、10mM t-CA、5％甘油，pH值为8.5。

13.根据权利要求2所述的方法，其中向步骤(f)中获得的超滤、或者超滤和渗滤的来自该HIC柱的包括该AvPAL变异体的洗出液添加非离子去垢剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中该非离子去垢剂是聚山梨醇酯80(PS80)。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述PS80的浓度是0.02％。

16.根据权利要求1所述的方法，其中该AIEX柱是Toyopearl Giga Cap Q 650M柱。

17.根据权利要求1所述的方法，其中该HIC柱是Toyopearl丁基650M柱。