[发明专利]使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增

说明书

本申请为国际申请日2011年8月16日、国际申请号PCT/EP2011/064114于2013年2月16日进入中国国家阶段、申请号201180039588.6、发明名称“使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增”的分案申请。

技术领域

本发明属于生物学和化学领域，特别是属于分子生物学领域。更具体地，本发明涉及用于扩增核酸的方法和试剂盒。

背景技术

核酸扩增被广泛用在研究、诊断学、法医学、医学、食物科学和农业中。“现场即时测试(Point of Care Testing)”(POCT)是指在患者医疗点处或附近进行的诊断性测试，即去集中化的检查，例如可以在私人医疗实践、小医院、药店中或者甚至在事故或其它医疗紧急事件的现场或位点处或者在救护车内执行所述检查。现场即时诊断需要快速且简单的测试。因此，在基于核酸的检测方法的情况下，与已建立的但较慢的基于PCR的方法相比，快速等温扩增技术最近已变得越来越重要。PCR需要热循环，以便将双链核酸例如DNA的两条链分离开。相反，例如等温扩增方法不需要热循环仪。

最杰出的等温扩增方法之一是所谓的解旋酶依赖性扩增(HDA)(例如被描述在Vincent等.(2004)，EMBO reports 5(8):795-800；Jeong等.(2009)，Cell.Mol.Life Sci 66:3325-3336；WO-A2 2004/027025；WO-A2 2006/074334中，所有均通过参考结合于此)。HDA是基于解旋酶将双链核酸特别是DNA解旋的能力，而不需要加热或甚至热循环。在HDA中，使用DNA聚合酶和合适的寡核苷酸引物来复制分离的DNA链。因此，HDA模拟天然的复制叉机制。HDA需要存在ATP、二价镁离子和dNTP。某些基于HDA的方法还采用单链结合蛋白(SSB)来包被置换的DNA链。事实上，取决于所使用的酶，可以在热不稳定或热稳定的反应中执行HDA方法。典型地，在25℃和50℃之间、优选在37℃和42℃之间的温度下执行热不稳定的HDA反应。相反，在超过50℃、典型地在60℃和70℃之间的温度下执行热稳定的HDA或嗜热的HDA(tHDA)反应。

HDA反应选择性地扩增由两个引物限定的靶序列。HDA使用解旋酶而不是像PCR中那样使用热来将双链核酸的两条链分离开。因此，可以在单个温度下执行HDA，而不需要热循环。常规的标准HDA反应的步骤示于图1中：在第一个步骤中，通过解旋酶将双链核酸解旋，产生(部分)单链的序列。然后，引物与单链区结合。在步骤2中，聚合酶合成互补链。最后，解旋酶和聚合酶共同起作用，导致模板的扩增(步骤3)。

其它等温扩增包括链置换扩增(SDA)，链置换扩增是基于使用限制性酶在DNA的未修饰链上造成切口并通过核酸外切酶缺陷的DNA聚合酶的作用来延伸切口处的3’末端以置换下游的DNA链。

另一种等温扩增是滚环扩增(RCA)，其中线性ssDNA被退火到环状ssDNA模板上，所述环状ssDNA模板是通过使用DNA连接酶连接模板DNA的两个末端而生成的。接着，使用DNA聚合酶延伸退火的引物，并生成互补模板序列的串联连接的拷贝。RCA和SDA两者都需要初始的热变性步骤。

其它等温扩增包括例如切口酶扩增反应(NEAR)和相关的指数扩增反应(EXPAR)，两者都采用切口酶和聚合酶来扩增短的双链模板序列(例如被描述在van Ness等.(2003)，Proc.Natl.Acad.Sci.100(8):4504-4509；US-A1 2003/0082590；WO-A2 2004/022701；WO-A22009/012246；WO-A2 2004/067726中，所有均通过参考结合于此)。

然而，所有上述等温扩增方法均需要复杂的反应方案，是相对慢的和/或仅限于相对短的模板序列。

发明内容

本发明提供了用于扩增核酸、优选双链核酸的改进的方法，所述方法克服了现有技术的这些限制。本发明的方法基于改良的HDA方法。所提供的方法比常规的tHDA快，同时具有可靠的特异性。与类似于NEAR和EXPAR的方法相比，本发明的方法可以扩增更长的模板核酸。

本发明涉及在切口核酸内切酶存在下执行的HDA扩增方法。因此，在本发明的情形下，在解旋酶、合适的聚合酶、和切口核酸内切酶存在下扩增模板核酸。