[发明专利]使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增

权利要求书

1.用于扩增模板核酸的非诊断性方法，

其中所述方法包括在切口核酸内切酶存在下使用解旋酶依赖性扩增(HDA)反应扩增所述模板核酸，并且

其中所述模板核酸包含由所述切口核酸内切酶识别的序列，或者在HDA反应期间由所述切口核酸内切酶识别的序列被引入到模板核酸中，其中HDA反应是嗜热的HDA(tHDA)，其中使用包含由切口核酸内切酶识别的序列的寡核苷酸引物将由切口核酸内切酶识别的序列引入到模板核酸中，并且其中扩增的序列短于400bp，以及

其中所述切口核酸内切酶是指识别完全或部分双链的核酸分子的核苷酸序列并在相对于识别序列而言的特定位置处只切割核酸分子的一条链的核酸内切酶，其中包含由切口核酸内切酶识别的序列的所述引物包含不与模板核酸杂交的5’标签序列，并且由切口核酸内切酶识别的序列处于所述标签序列中，

并且其中所述方法还包括初始的热变性步骤。

2.权利要求1的方法，其中模板核酸是双链模板核酸。

3.权利要求1的方法，其中解旋酶选自：超家族I解旋酶；超家族II解旋酶；超家族III解旋酶；来自于dnaB样超家族的解旋酶；以及来自于rho样超家族的解旋酶。

4.权利要求1的方法，其中聚合酶选自Bst DNA聚合酶、PyroPhage聚合酶、DisplaceAce聚合酶和Vent(exo-)聚合酶。

5.权利要求1的方法，其中切口核酸内切酶选自Nb.BsmI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BsmAI、Nt.BbvCI、Nt.BspQI和Nt.AlwI。

6.权利要求1的方法，其中在超过50℃的温度下执行HDA扩增反应。

7.权利要求1的方法，其还包括检测扩增产物的步骤。

8.权利要求7的方法，其中使用凝胶电泳、嵌入染料或特异性寡核苷酸探针来检测扩增产物。