[发明专利]一种检测猪细菌性肠炎病原的多重PCR特异性引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物医学的分子生物学领域，具体涉及检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物及其应用。

背景技术

猪细菌性肠炎在临床生产中长期存在，并导致生长速度减慢和大量死亡。引起猪肠炎的病原主要为大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌，其中大肠杆菌导致仔猪黄白痢、断奶仔猪腹泻和肠道水肿等；沙门氏菌导致仔猪副伤寒和育肥猪拉稀等；产气荚膜梭菌导致仔猪红痢和肥猪阶段肠道胀气等。猪细菌性肠炎病程短，传播快，病情发展迅速，死亡率高。

猪大肠杆菌在猪群中引起很多疾病，包括新生仔猪腹泻、断奶仔猪腹泻和肠道黏膜下层水肿。由于发病率、死亡率和体重降低的增加，以及治疗、疫苗和饲料添加剂的成本增加，大肠杆菌引起的腹泻和水肿病造成了巨大的经济损失。

猪沙门氏菌多爆发于断奶的幼崽猪群，临床症状主要表现为小肠结肠炎、腹泻及脱水。本病常发生于感染了大剂量沙门氏菌，免疫抑制，且体质虚弱及卫生条件差的猪群。临床急性发病猪，其排菌可达每克粪便含106个猪霍乱沙门氏菌(Smith HW,Jones JET.1967.J Pathol 93:141-156.)或107个鼠伤寒沙门氏菌(Gutzmann F,Layton H,Simiins K,et al.1976.Am J Vet Res 37:649-655.)。

猪产气荚膜梭菌病在世界范围内流行，其病原梭菌是一类严格厌氧的革兰氏言行产芽胞杆菌，其中引起肠炎的主要为C型和A型产气荚膜梭菌。其中C型产气荚膜梭菌病例通常出现在仔猪出生以后3天，增殖快，世代间隔短，在数小时内，可以增殖到108-109个/g(Ohnuna Y,Kondo H,et al.1992.J Jpn Vet Diagn Invest 14:258-259)，感染仔猪迅速转变为虚脱，勉强运动，然后很快转并为濒死期，多数病例会在出生后12-36h死亡。A型产气荚膜收集是猪肠道内正常微生物区细的组成部分，一旦条件适宜就大量增殖，引起新生仔猪、偶尔也可以引起断奶仔猪的肠道疾病。

大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌这三种病原菌也是人畜共患的感染原，人群极易通过接触或食用带菌的食物而感染，尤其是对老人小孩人群，感染后会引发消化道炎症、出血性腹泻、败血症、伤寒等病症，伤害极大。

目前实验室对大肠杆菌和沙门氏菌进行有氧培养，对产气荚膜梭菌进行厌氧培养，并且分别进行三种病原菌的生化试验或者单病原PCR鉴定。培养过程耗时较长且目标盲目，尤其厌氧培养对硬件和操作熟练度要求高，而单病原PCR鉴定需要对三种病原分别进行检测耗时长试剂使用量大。

综上所述，现有技术还存在较大不足。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物及利用该引物建立的检测方法，特异性强和敏感性高，可满足临床上简便、快速、准确进行区分鉴定的要求，为临床生产对该病的免疫防控提供依据。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的多重PCR特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示。

进一步的，所述引物的模板基因为大肠杆菌uidA1和uidA2基因、沙门氏菌invA1和invA2基因、产气荚膜梭菌clo1和clo2基因。

一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的试剂盒，包含上述多重PCR特异性引物。

进一步的，所述试剂盒还包括：PCR预混液、无菌双蒸水；

所述PCR预混液包括：DNA聚合酶、pH8.3Buffer Tris-HCl、KCl、MgCl₂、dNTPMixture。

进一步的，所述特异性引物在猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌检测中的应用。

一种检测猪细菌性肠炎病原大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的方法，包括：利用所述引物对待检样品进行PCR扩增；收集扩增产物进行电泳实验；判读电泳结果。

所述PCR反应体系包括：PCR预混液12.5μL、引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各1μL、引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4各0.5μL、引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6各1.5μL、无菌双蒸水6.5μL；

所述引物的浓度均为10pmol；