[发明专利]一种核酸扩增的检测方法

说明书

本发明提供了一种核酸扩增的检测方法，在第一PCR管加入反应扩增液，在第二PCR管加入钙黄绿素和MnO₂纳米材料，在第三PCR管加入焦磷酸盐溶液；试纸条探针分别放置在第二PCR管和第三PCR管中，或者，在第一PCR管放入抗原修饰的引物；以具有三个接口的可视化核酸扩增检测装置作为盖，将三个PCR管分别密封连到可视化核酸扩增检测装置的三个接口上，反应结束后，将反应扩增液，钙黄绿素，MnO₂和焦磷酸盐溶液混合，本发明通过判断混合液的颜色是否为黄绿色判断混合均匀，然后再进行试纸条检测核酸恒温扩增结果，能在不开盖的情况下监控试纸条检测前样品混匀程度，使采用试纸条检测的结果更加准确。

技术领域

本发明属于核酸分析与检测领域，具体涉及一种核酸扩增产物的可视化检测方法。

背景技术

核酸扩增技术在当今的分析检测领域具有十分重要的意义。食品安全检测、环境监控、医疗诊断、法医鉴定等领域无不依赖于核酸扩增技术。最早也是最经典的核酸扩增技术是在耐热性聚合酶的作用下，依靠温度的不断循环交替而实现模板变性、引物退火及延伸从而实现目标产物的大量积累，这种技术被称作聚合酶链式反应(PCR)。然而，PCR最大的缺陷也就在于，其不断的温度变化过程对仪器(PCR仪)提出了相对高的要求，并进而限制了其扩增速率。恒温扩增的出现彻底摆脱了对精密温控设备的依赖，仅仅一个热块、一台水浴锅甚至一只保温效果良好的保温瓶、热水瓶等即可满足反应需求。常见的恒温扩增技术包括：环介导等温扩增(LAMP)、重组聚合酶扩增(RPA)、链置换扩增(SDA)、依赖解旋酶的扩增(HDA)、切口酶介导的扩增反应(NEAR)等等。恒温扩增的出现为现场快速检测提供了十分大的便利。

然而，一个重要问题仍然限制核酸扩增现场快速检测，即对扩增产物的快速特异性检测。钙黄绿素通常用于核酸恒温扩增产物的可视化检测，但是常用的方法是在核酸扩增液中添加Mn²⁺猝灭钙黄绿素的荧光。随着核酸扩增的进行，释放大量的焦磷酸盐的时候，焦磷酸盐由于与Mn²⁺的结合作用更强，从而使钙黄绿素脱离Mn²⁺，荧光恢复。这种方法除了检测结果不够特异以外，Mn²⁺的引入也会对扩增本身有较大的抑制作用。同时，对于扩增效率比较低的样本其本身焦磷酸盐产生的量就不多，因而钙黄绿素的荧光恢复不明显。同时由于反应本身产生的焦磷酸盐并不会足够多，所以对钙黄绿素和Mn²⁺的用量提出了严格的要求。

可视化试纸条用于核酸扩增检测具有特异、方便、快速、结果可靠、成本低廉等优点。但是，利用试纸条对核酸扩增结果进行检测通常需要较大体积(通常50-200μL)检测液体，以便扩增分子在试纸条上顺畅而快速的流动。但是在利用试纸条对核酸扩增结果进行检测的过程中，往往有几个方面的因素限制了扩增产物直接用于试纸条检测，必须通过对扩增产物进行稀释后才能用于试纸条检测，如：(1)反应试剂体积的增大往往意味着反应成本骤增；(2)核酸扩增反应试剂中经常含有某些试剂(如PEG，PVA等)导致扩增体系的过于黏稠，影响样品分子在试纸条上的涌动，造成检测结果的不准确；(3)某些通过探针检测的体系必须在反应后加入探针、缓冲溶液；(4)扩增产物量太大，超出所设计纸条的检测范围，造成钩状效应；等等。这些因素的存在都要求试纸条检测过程中必须加入额外的试剂以保证检测结果的准确性。然而在开盖操作的情况下，扩增产物容易形成气溶胶污染，影响后续检测结果的准确性。针对此问题，目前有多种检测装置，发明人开发出了一种装置(ZL 2015 20424418.5)，能够在不开盖的情况下实现对扩增产物的稀释。

但是，依靠这些装置，稀释过程中样品的混合均匀程度对检测结果仍然有很大的影响，如果样品没有混合均匀将直接影响检测结果的准确性。而如何判断样品是否混合均匀却是一个难题。因此，本发明利用钙黄绿素的荧光猝灭效果，结合核酸试纸条的检测特异性，提出了一种利用钙黄绿素检测核酸扩增产物混合均匀程度的方法，进一步保障核酸试纸条检测结果的准确性。

发明内容