[发明专利]一种标记植物花粉微丝微管细胞骨架的方法及其试剂盒

说明书

本发明提供一种用于标记植物花粉微丝微管细胞骨架的试剂盒，包括花粉固定液试剂A，花粉洗涤液试剂B，花粉微丝染料试剂组合C，以及花粉微管染料试剂组合D。本发明还提供利用该试剂盒标记植物花粉微丝微管细胞骨架的方法，具体流程如下：培养花粉—固定花粉管—洗涤花粉管—微丝染料室温染色花粉管—微管染料室温染色花粉管—激光共聚焦显微镜观察。本方法可实现快速、灵敏、准确性高、简便地观察木本植物花粉管内微丝微管骨架结构与排列方式，为直观观察木本植物花粉管内微丝微管骨架结构与排列方式提供技术支持。

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地说，涉及一种标记植物花粉微丝微管细胞骨架的方法及其试剂盒。

背景技术

植物的细胞骨架包括微丝和微管，它们组成不同的列阵参与细胞分裂、生长和分化等众多的生理过程。不同的真核生物细胞骨架的排列差异很大，花粉管细胞中的微丝微管骨架在生殖过程中承担着重要的角色。清晰直观地观察细胞骨架的排列对了解花粉管如何通过信号转导、胞吞胞吐、极性生长过程参与有性生殖有着重要的意义。由于花粉管存在材料收集困难及木本植物的细胞壁组成成分较为复杂，因此对于苹果花粉管中细胞骨架的研究更为困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于标记植物花粉微丝微管细胞骨架的试剂盒。

本发明的另一目的是提供利用上述试剂盒标记苹果花粉微丝微管细胞骨架的方法。

为了实现本发明目的，本发明用于标记植物花粉微丝微管细胞骨架的试剂盒，所述试剂盒包括花粉固定液试剂A，花粉洗涤液试剂B，花粉微丝染料试剂组合C，以及花粉微管染料试剂组合D。

其中，所述试剂A由多聚甲醛、EGTA、PIPES、MgCl₂和蔗糖组成；所述试剂B由Tris-HCl、NaCl和蔗糖组成；所述试剂组合C包括0.1～0.15％NP-40(优选0.15％)、0.06～0.08％NP-40(优选0.08％)和Alex-561-phalloidin染色液；所述试剂组合D包括Cellulose和PectolyaseY-23混合液、0.1～0.15％NP-40(优选0.15％)、0.06～0.08％NP-40(优选0.08％)、甘氨酸溶液、一抗anti-a-Tubulin、二抗FITC-anti-mouse-IgG以及Tris-HCl、NaCl和甘氨酸的混合液。

优选地，本发明所述植物为苹果。

所述试剂A中多聚甲醛的质量体积比为5～6％(优选6％)、EGTA的浓度为2～3mM(优选3mM)、PIPES的浓度为50～60mM(优选60mM)、MgCl₂的浓度为2～3mM(优选3mM)、蔗糖的质量体积比为10～15％(优选15％)。

所述试剂B中Tris-HCl的浓度为50～60mM(优选60mM)，pH7.0，NaCl的浓度为200～250mM(优选250mM)，蔗糖的质量体积比为10～15％(优选15％)。

所述试剂组合C中，0.1～0.15％NP-40用花粉萌发液配制；0.06～0.08％NP-40用TBSS配制；Alex-561-phalloidin染色液中Alex-561-phalloidin的浓度为150nM，pH7.0的Tris-HCl浓度为50～60mM(优选60mM)，NaCl的浓度为200～250mM(优选250mM)，蔗糖的质量体积比为10～15％(优选15％)。

其中，所述花粉萌发液的配方为：葡萄糖0.08～0.1g/ml、CaCl₂ 0.25～0.3mg/ml和硼酸0.08～0.1mg/ml。

本发明所述TBSS由pH7.0 60mM的Tris-HCl，250mM NaCl和质量体积比为15％的蔗糖组成。