[发明专利]一种拟穴青蟹抗病因子SpALF6单核苷酸突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种拟穴青蟹抗病因子SpALF6单核苷酸突变体及其制备方法和应用。本发明涉及水产动物新型天然药物与饲料添加剂开发和应用技术领域，具体是一种拟穴青蟹抗病因子SpALF6单核苷酸突变体SpALF6‑M，其全长核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，全长氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明还提供SpALF6‑M的制备方法和应用。本发明制备的SpALF6‑M对真菌和病原性细菌(特别是耐药性弧菌)具有明显的抑制和杀伤作用，表明其在抗微生物感染新药和新型抗病饲料添加剂的开发和应用方面具有非常诱人的应用前景。

技术领域

本发明属水产动物新型天然药物与饲料添加剂开发和应用技术领域，特别涉及一种拟穴青蟹抗病因子SpALF6单核苷酸突变体SpALF6-M，及其制备方法和应用。

背景技术

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国乃至世界重要的海水经济蟹类。拟穴青蟹又称青蟹，属节肢动物门、甲壳纲、十足目、青蟹属，在我国主要分布于东南沿海近海海域，目前在长江口区域如崇明岛也有养殖，属我国传统海洋渔业资源和海水养殖蟹类，具有重要经济价值。青蟹具有生长快、体型大、肉味鲜美等优点，深受消费者青睐。青蟹养殖主要分布在东南沿海区域，近年来，养殖区域已扩大到长江口流域，经形成了较大的养殖规模，养殖青蟹年产量一直稳定在10万吨以上，保持了稳定的发展势头。

目前，病害是制约青蟹养殖业发展的重要瓶颈。培育抗病能力强的青蟹新品种是促进青蟹养殖业健康发展的一个重要任务。抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharidefactor，ALF)首次发现于鲎体内，因该因子具有抗凝血作用，能够抑制细菌脂多糖(LPS)引发的凝集反应，故命名为抗脂多糖因子。最早发现的鲎LALF对R-型革兰氏阴性菌具有强烈的抑制作用。随后对ALF的分子结构进一步研究表明，ALF对LPS具有高亲和力，能够结合LPS类脂A并中和其生物学活性。目前，多种甲壳动物ALF在对虾、螯虾、蟹等动物体内相继被鉴定。该类蛋白对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌及WSSV等具有不同程度的杀灭或抑制作用，表明ALF是动物体内重要的抗病因子。

目前水产养殖动物中细菌耐药现象较为普遍，常规药物使用经常达不到预期效果，不但药物使用浪费，还不能挽回因病害带来的经济损失，因此开发新型抗耐药菌药物也是水产病害防治的一个重要课题。在创制本发明过程中，我们发现该蛋白对常见水产动物病原具有广谱抗菌活性，特别是对耐药性溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌也具有显著抑制效果，因此该蛋白在制备抗水产动物饲料添加剂方面具有光明的应用前景。此外，SpALF6的单氨基酸突变体SpALF6-M对真菌抑菌活性显著增强，特别是对白色念珠球菌生长抑制活性。虽然目前的研究显示ALF家族蛋白具有较为广谱的抗微生物活性，但该类蛋白抗白色念珠球菌活性的报道却很少，鉴于白色念珠球菌是包括人在内高等动物病原，通过一定的途径获取SpALF6-M蛋白可以作为新型抗真菌药物。

此外，大肠杆菌表达系统是制备蛋白产品有效方法，由于该方法产量大、成本低、制备过程相对简单，是目前大量获取外源蛋白的主要途径。在创制本发明专利过程中，发现SpALF6-M可在本研究构建的大肠杆菌表达系统中可溶性表达。与蛋白表达过程中形成不可溶的包涵体相比，生产工艺和成本会显著降低，因此本发明所创制的SpALF6-M制备方法为新型药物和水产饲料添加剂的开发和推广应用创造了条件。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拟穴青蟹抗病因子SpALF6单核苷酸突变体SpALF6-M，及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种拟穴青蟹抗病因子SpALF6，其全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SpALF6的全长cDNA(SEQ ID NO:1)为681bp，其中第79位至第426位的核苷酸为编码氨基酸序列的开放阅读框(SEQ ID NO:5)，全长348bp。