[发明专利]一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及水生动物病害检测技术领域，特别涉及一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒。

背景技术

虾肝肠微孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)病是由一种微孢子虫(microsporidia)寄生引起的，根据2009年在泰国斑节对虾(Penaeus monodon)上表现出来的症状而命名，主要存在于虾肝胰腺(HP)中，2014年以来EHP疫情正在中国、印尼、印度、马来西亚和泰国等地广泛发生，因此EHP是养殖虾病害中的一个新兴问题，已给全球养殖虾产业造成极大的危害，迫切需要控制。研究已发现EHP能够感染南美白对虾(Penaeus vannamei)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、日本沼虾、斑节对虾等，而且既可以垂直传播也可以水平传播，虾与虾之间的直接传播方式可能是经口传播；EHP主要感染虾的肠道表皮，进而感染肝胰腺，引起对虾肠道吸收功能下降，严重的出现肠炎和肝胰腺萎缩，导致虾在养殖过程中出现生长速度缓慢，个体差异大、参差不齐的现象，但并不会立即死亡，相反虾肠道饱满，食欲正常，所以从表面上看起来，虾并没有明显疾病症状，仅偶尔伴随有白便或者在应激条件下才出现大量死亡；由于患病对虾也一直吃饲料，所以养殖投入高，结果收获甚微，给养殖业造成巨大的经济损失。

EHP是一种很小的孢子虫，比一般的微孢子虫小很多，比一般的细菌都小，又不形成肉眼可见的胞囊，没有经验很难辨别。其在肝胰腺细胞质中由早期原生质阶段发育成成熟的孢子，胞质中的多核原生质体阶段在原生质体表面存在大量的小泡，在早期原生质发育阶段以质核二分裂方式形成大量的孢子前体，待胞质形成电子密度盘和极管前体后，早期孢子于原生质表面以出芽方式释放。成熟孢子椭圆形，大小为0.7×1.1μm，具单核，有一锚盘连着极丝、后端有一个空泡，孢子壳电子密度高，壳由质膜、透明芽孢和透明外壁组成。目前该病原的检测方法主要是利用染色的活组织印片、涂片或切片光镜检查，或者采用电镜法以及PCR检测法，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是操作繁琐，对实验人员技术要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作；二是对检测设备要求高，养殖企业和基层检测机构无法实现常规检测；三是检测方法耗时长，灵敏度不高，容易漏检。

LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术(LAMP)的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶作用下进行恒温扩增，简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。其中荧光染料法具有安全、快捷、高效的特点，适合应用推广。目前，该技术在虾肝肠微孢子虫(EHP)的检测中未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，该试剂盒特异性强，灵敏度高，操作简便快捷，克服现有检测方法在养殖病害监测中无法直接应用的问题，适合虾肝肠微孢子虫病的筛查与预防。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，包括组织裂解液及LAMP扩增反应液，所述LAMP扩增反应液各组分如下：LAMP内引物各1.4mM，LAMP外引物各0.2mM，20mM Tris-HC，10mM氯化钾，15mM硫酸铵，8mM硫酸镁，0.1％Triton X-100，0.6M甜菜碱，1.4mM dNTP，2.5U/μL Bst DNA聚合酶大片段，1.25mM钙黄绿素，25mM MnCl₂，水余量。

本发明开发了适用于虾肝肠微孢子虫LAMP检测的反应体系，LAMP扩增反应液各成分的组合实现了LAMP扩增后能进行荧光检测得到结果，而常规的LAMP扩增反应体系则难以实现荧光检测，无荧光或荧光无法分辨结果。

本发明针对虾肝肠微孢子虫基因组DNA设计开发了特异性强、灵敏度高的特异性LAMP引物，相对于普通的PCR引物检测效果更好，特异性更强、灵敏度更高。