[发明专利]一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清狂犬病疫苗制品

说明书

技术领域

本发明涉及狂犬病疫苗原液的制备方法，尤其涉及用生物反应器微载体培养无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法以及无血清狂犬病疫苗制品。

背景技术

目前，大量生产人用狂犬病疫苗所利用的细胞基质包括原代细胞，如地鼠肾原代细胞(PHKCV)和鸡胚原代成纤维细胞(PCECV)等；连续传代细胞，如非洲绿猴肾细胞(Vero)和人二倍体细胞等。Vero细胞是世界卫生组织认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比较，Vero细胞具有可连续传代、生长速度快、遗传性状稳定，恶性转化程度低、生物安全性较高、培养条件要求不苛刻、易于在生物反应器实施大规模培养等优势。

作为贴壁成纤维细胞，Vero细胞对血清有依赖性，因为血清能为细胞的体外培养提供必要的生长因子，激素，细胞贴附因子和营养成分，现在中国大陆上市的Vero细胞基质的狂犬病疫苗都需要含血清培养基制备。

利用牛血清作为Vero细胞培养和疫苗制备的培养基补充成分,具有诸多不利因素：血清组分的复杂性和不确定性，导致血清生产批次间的质量差异，增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量；血清中存在病毒(如朊病毒)等病原微生物污染的潜在风险，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患；血清对病毒有一定的抑制作用，特别是一些需要胰酶激活才能很好感染细胞的病毒(如轮状病毒等)，有血清培养基中的血清中和了胰酶，使病毒不能充分激活，从而降低了所收获病毒的滴度。由于以上情况，美国、欧盟和日本等发达国家已经全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。

现有的无血清培养技术多停留在方瓶、转瓶和细胞工厂(多层静止瓶)水平。而方瓶、转瓶及细胞工厂作为培养容器，存在工艺参数不容易控制，无法实现细胞的高密度培养和获得较高滴度的病毒液，产品的均一性也得不到保证。因此，开发能够大规模生产的生物反应器微载体无血清培养Vero细胞人用狂犬病疫苗病毒原液的制备方法是十分必要的。

现有技术的缺陷可归纳成如下几点。

1.有血清疫苗生产不稳定、质量难以控制；

2.血清中潜在的病毒微生物有不安全隐患；

3.血清对病毒有一定的抑制作用，使用有血清培养基培养Vero细胞和制备病毒液，使病毒收获液滴度较低。

4.方瓶、转瓶及细胞工厂作为培养容器，不能很好地控制工艺参数，不利于细胞生长过程中的气体交换及营养充分供应，不能很好地控制工艺过程，无法实现细胞的高密度培养和获得较高滴度的病毒液，也难以实现产品的均一性。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的缺陷，提供一种无血清培养Vero细胞狂犬病疫苗病毒原液的制备方法以及无血清狂犬病疫苗制品，制备出均一性好、滴度高、无血清成分和安全性高的无血清病毒性疫苗原液，为大规模生产无血清培养生产Vero细胞基质的人用狂犬病疫苗奠定基础。

本发明的第一技术方案为一种无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，其特征在于，包含以下步骤，

步骤1.用无血清培养基培养Vero细胞，获得无血清培养基适应细胞株；

步骤2.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞种子库；

步骤3.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子库；

步骤4.使用无血清培养基复苏、培养、传代、扩增Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，细胞扩增后，应用生物反应器和微载体，使用无血清培养基，连续灌流培养高密度Vero细胞；

步骤5.接种狂犬病疫苗毒株工作种子库毒种后，进行生物反应器微载体无血清培养，在病毒扩增至高峰时，开始连续灌流收获病毒液，收获液病毒滴度，经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化处理，得到无血清人用狂犬病疫苗原液。

第二技术方案基于第1技术方案，其特征在于，所述步骤2中，直接以无血清培养基复苏、培养和传代扩增所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞主种子库和工作种子库。