[发明专利]一种在体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法

说明书

本发明涉及一种在体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法。本发明在LncRNA基因序列3’末端设计PPR蛋白特异性识别碱基，将PPR蛋白和LncRNA过表达质粒共转染细胞，使PPR和LncRNA在细胞内大量表达，然后通过Anti‑Flag抗体富集PPR蛋白，进而间接富集LncRNA，实现了在体内成功获得并纯化大量目的LncRNA。本发明可明显简化现有技术中体外转录获得目的LncRNA的步骤，且经济简便，可行性强，便于LncRNA相关实验的研究，在LncRNA的作用机制研究领域提供了崭新的思路。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种在体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法。

背景技术

目前，长链非编码RNA(LncRNA)的研究十分广泛。已证明LncRNA在肿瘤的发生发展中起到关键作用，并且具有组织特异性和时空特异性。在研究LncRNA的功能机制时，多数研究人员需要在体外获得大量的LncRNA，然后通过体外实验证明LncRNA和核酸以及蛋白之间的相互作用，从而研究其在细胞和组织中的功能特点。通过相应的DNA模板、RNA转录酶、NTP以及其他相应的反应条件，在体外大量获得LncRNA的方法，称为“体外转录法”。通过体外转录法获得LncRNA的方法是目前主流的获得LncRNA的方法，但是该方法有其缺陷：一、体外获得的LncRNA对实验条件研究严格：在体外通过转录获得LncRNA，转录常常不完整，且由于体外难以做到彻底清除RNA酶，转录出的LncRNA如果长度较长，常常会边转录边降解，从而影响后续的实验；二、体外转录的实验成本较大：体外转录的相关试剂常常价格昂贵；三、体外转录后续实验难度大：体外转录获得的LncRNA，后续研究的实验一般也在体外完成，如研究LncRNA和蛋白相关作用，需要将蛋白裂解后再与LncRNA相互作用，通过质谱检测或者WB明确相互作用的蛋白，实验的条件要求严格，费用高。四、由于在LncRNA体外转录相关的后续研究也在体外完成，获得的LncRNA由于未在细胞中进行自然加工与合成，无法很好的还原真实的细胞内环境，往往会导致大量的假阳性结果。

综上所述，亟需一种经济简便，可行性强的获得并纯化大量目的LncRNA的方法。

PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白对单链RNA具有序列特异性识别模式，具体模式为：PPR蛋白由数目不等的重复单元串联而成，每个经典PPR重复单元含有35个氨基酸，可以特异性地识别一个RNA碱基，并且第5位和第35位氨基酸在RNA特异识别过程中发挥着重要作用，被称为密码氨基酸。

目前关于应用PPR蛋白在体内高效富集目的LncRNA的方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种在体内获得大量目的LncRNA的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种在体内获得并纯化大量目的LncRNA的方法，包括以下步骤：

a)将带有标签蛋白的PPR蛋白的过表达载体与LncRNA过表达载体共转染工具细胞，所述的LncRNA过表达载体的LncRNA基因序列下游带有PPR蛋白的特异性识别碱基序列；

b)培养工具细胞；

c)裂解工具细胞，富集和纯化PPR蛋白，进而间接地富集和纯化得到LncRNA。

所述的PPR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的PPR蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的PPR蛋白过表达载体的构建方法为：将PPR蛋白的基因序列插入到pcDNA3.1载体的HindIII和EcoRI位点之间，并于PPR蛋白的基因序列上游插入标签蛋白的编码序列。

所述的PPR蛋白的特异性识别碱基序列如SEQ ID NO.2所示。