[发明专利]一种利用环糊精葡萄糖基转移酶转糖基反应提高染料木素水溶性的方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种利用环糊精葡萄糖基转移酶转糖基反应提高染料木素水溶性的方法，属于酶工程领域。

背景技术

大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，主要存在于大豆种子的子叶和胚轴中。其中，染料木素(又名金雀异黄素、染料木黄酮等)被认为是大豆异黄酮类物质中活性功能最高的一种。在豆科植物中，染料木素经常以其葡萄糖苷衍生物即染料木苷(又名4',5,7-三羟异黄酮-7-糖苷)的形式存在。染料木素在人体及动物细胞中具有广泛的药理学功效。主要表现为：1)具有化学防癌(乳腺癌和前列腺癌等)作用。染料木素具有类雌性激素及抗激素作用，可以抑制肿瘤细胞合成过程中相关酶的活性，在肿瘤细胞形成过程中抑制肿瘤血管增生，延缓或阻止肿瘤变成癌细胞。2)可以预防心血管疾病。染料木素会激发低密度的脂蛋白受体产生正向调节作用，同时可以促进胆固醇的清除，抑制血小板的凝集，对于动脉粥样硬化等疾病具有预防和治疗作用。3)可以预防绝经后疾病。染料木素是典型的植物雌激素，所具有的雌激素活性能够缓解妇女更年期综合症及预防绝经后疾病。4)抗骨质疏松作用。染料木素的雌激素活性能够激活雌激素受体，提高成骨细胞活性；另外还可以增加骨密度，抑制骨量丢失，对骨质疏松具有较好的改善作用。

然而，染料木素具有很强疏水性，几乎不溶于水，在一般的有机溶媒中溶解度较差，而易溶于二甲基亚砜等有机溶剂。由于染料木素在水溶液中的溶解度极低，不仅限制了其作为食品添加剂、化妆品以及其他水溶性产品的应用，而且也大大降低了其作为口服药物及静脉注射药剂的药用效果，限制了其医药行业中的应用。因此，如何提高染料木素在水溶液中的溶解度，成为目前国内外关注的焦点。其中研究较多的是染料木素的糖基化衍生物。据报道双葡萄糖基染料木素和三葡萄糖基染料木素在水中的溶解度分别是染料木素的3700倍和44000倍。糖基化染料木素相比与染料木素具有如下优点：1)与染料木素具有相似的生理生化功能；2)在体内水解为可被人体吸收的葡萄糖与染料木素，安全性较高；3)与染料木素相比水溶性明显的改善，拓展了其的应用范围。因此，糖基化染料木素具有十分重要的应用价值。目前常见的催化糖基化反应的酶有β-糖苷酶(EC 3.2.1.120)，麦芽糖淀粉酶(EC 3.2.1.133)，4-α-葡聚糖转移酶(EC 2.4.1.25)和环糊精葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.19)。我们将来源于Peanibacillus macerans的环糊精葡萄糖基转移酶编码基因cgt成功在Escherichia coli中异源表达，并采用密码子优化方法提高其表达量。该酶应用于染料木素转糖基反应，发现有较好的效果。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌。

所述的环糊精葡萄糖基转移酶基因来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans JFB 05-01，CCTCC NO：M208063)，并完成了密码子优化，基因序列如(GenBank accession no.JX412224)所示。

所述的产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌为本发明要求保护的范围。该工程菌主要构建过程如下：

1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述的环糊精葡萄糖基转移酶基因；

2)将步骤1)获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因连接至大肠杆菌表达载体pET20b(+)，得到重组表达载体；

3)将步骤2)获得的重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)得到基因工程菌。

所述的克隆、转化方法为本领域常规的分子操作方法。

本发明需要解决的第二个技术问题是提供一种所述的环糊精葡萄糖基转移酶的生产方法，主要步骤如下：

以产环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌为生产菌株，活化后接种至含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在适当温度(30～37℃)振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入0.01mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在低温(16～25℃)继续振荡培养一定时间(85～95h)后，低温离心除去菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。经硫酸铵盐析，透析，以及镍柱亲和层析，获得较纯的环糊精葡萄糖基转移酶并冻干备用。