[发明专利]血清复合靶核酸适配体筛选方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种血清复合靶核酸适配体筛选方法。

背景技术：

核酸适配体是由一段DNA或RNA组成的能与各类靶标分子结合的化学抗体。可应用于食品检测、环境污染检测和肿瘤诊断及治疗等领域。由于适配体是体外人工快速合成的，可PCR扩增，对热不敏感，可重复利用，克服了抗体受免疫系统限制，生产周期长，稳定性差，储存条件苛刻等缺陷。

已经报道的快速筛选方法有毛细管电泳的筛选方法，这类方法库容量小，需要多次筛选，另一类是细胞筛选的方法，筛选效率低，周期长。

发明内容：

本发明的目的是提供一种解决了从异常血清中筛选得到与正常人血清有差异蛋白的核酸适配体，简化了筛选步骤，缩短了筛选周期，整个筛选进程由q-PCR检测的血清复合靶核酸适配体筛选方法。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

一种血清复合靶核酸适配体筛选方法，本筛选方法包括四步，第一步将待筛选的血清复合靶与琼脂磁珠偶联，形成琼脂磁珠-血清复合物，37 ℃孵育6小时；第二步将随机寡核苷酸文库进行加热变性处理，与琼脂磁珠-血清复合物相结合，用缓冲液冲洗掉未结合和结合力弱的靶标分子ssDNA，获得与血清复合物结合的核酸适配体分子；第三步对血清复合物的核酸适配体分子通过q-PCR扩增，再用PCR扩增产物制备得到次级ssDNA库，通过q-PCR动态检测与血清复合物结合的核酸适配体；第四步重复第二步所述的，筛选得到高特异性、强亲和力的血清复合物核酸适配体。

所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，所述的第二步随机寡核苷酸文库是将5nmol 随机寡核苷酸溶于4mL结合缓冲液中，所述的结合缓冲液是磷酸缓冲液和5mol／L MgCl2组成的溶液。

所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，磷酸缓冲液和5mol／L MgCl2比例为20：1。

所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法， 所述的第二步的靶标分子ssDNA是与琼脂磁珠-血清复合物结合的ssDNA。

所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法， 所述的第三步制备次级ssDNA库包括如下步骤：将q-PCR扩增后的产物与链霉亲和素磁珠37℃孵育6小时，用1%tween+磷酸缓冲液在80℃水浴3次，然后加入2ml结合缓冲液，变性并收集上清液，4℃保存，即制备得到次级ssDNA库。

有益效果：

1.本发明的血清复合靶核酸适配体筛选是从异常血清中筛选得到与正常人血清差异蛋白的核酸适配体，利用q-PCR动态检测筛选进程，操作简单，便于快速筛选得到血清复合靶核酸适配体。

2.本发明的筛选复合靶核酸适配体简单、快速，成本低，易于实现自动化。

3.本发明的筛选方法是从异常血清复合物中筛选差异蛋白核酸适配体，而毛细管电泳筛选方法是毛细管电泳只能筛选单一靶标的核酸适配体，与细胞筛选适配体相比，筛选出的核酸适配体可以组装成相应疾病的筛查试剂盒，本筛选方法易于实现自动化。

4.本发明中如果加入充足的琼脂磁珠，就能够充分结合血清中的蛋白，且收集和洗脱过程简单，易于自动化。

5.本发明的筛选方法流程简单、快速，不需要昂贵的耗材，降低了成本。

6.本发明的筛选方法所筛选的适配体可用于获取特异性蛋白。

7.本发明的筛选方法所筛选到的适配体可用于靶向药物的构建。

具体实施方式：

下面将结合本发明，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1：

一种血清复合靶核酸适配体筛选方法，本筛选方法包括四步，第一步将待筛选的血清复合靶与琼脂磁珠偶联，形成琼脂磁珠-血清复合物，37 ℃孵育6小时；第二步将随机寡核苷酸文库进行加热变性处理，与琼脂磁珠-血清复合物相结合，用缓冲液冲洗掉未结合和结合力弱的靶标分子ssDNA，获得与血清复合物结合的核酸适配体分子；第三步对血清复合物的核酸适配体分子通过q-PCR扩增，再用PCR扩增产物制备得到次级ssDNA库，通过q-PCR动态检测与血清复合物结合的核酸适配体；第四步重复第二步所述的，筛选得到高特异性、强亲和力的血清复合物核酸适配体。

实施例2：

实施例1所述的血清复合靶核酸适配体筛选方法，所述的第二步随机寡核苷酸文库是将5nmol 随机寡核苷酸溶于4mL结合缓冲液中，所述的结合缓冲液是磷酸缓冲液和5mol／L MgC_l2（氯化镁）组成的溶液。

实施例3：