[发明专利]一种利拉鲁肽的制备方法

权利要求书

1.一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)固相合成利拉鲁肽的4个肽片段，其中肽片段1为利拉鲁肽主链序列中的第1-9位氨基酸；肽片段2为利拉鲁肽主链序列中的第10-14位氨基酸；肽片段3为利拉鲁肽主链序列中的第15-23位氨基酸；肽片段4为利拉鲁肽主链序列中的第24-31位氨基酸；

2)将各肽片段逐步偶联，得到全保护的利拉鲁肽主链肽树脂；

3)脱除第20位赖氨酸的保护基，并完成侧链的连接，得到全保护的利拉鲁肽肽树脂；

4)经裂解、纯化、冻干，得到利拉鲁肽；

具体为：

1)采用固相合成法，以树脂为载体，在缩合剂与活化剂的作用下，分别合成利拉鲁肽的肽片段1、2、3、4的树脂；其中肽片段1为利拉鲁肽主链序列中的第1-9位氨基酸；肽片段2为利拉鲁肽主链序列中的第10-14位氨基酸；肽片段3为利拉鲁肽主链序列中的第15-23位氨基酸；肽片段4为利拉鲁肽主链序列中的第24-31位氨基酸；

2)在裂解液的作用下，分别将肽片段1-3从树脂上裂解下来，得到全保护肽片段1-3；脱去肽片段4树脂上的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，将肽片段3与肽片段4树脂偶联，得到肽片段5树脂；脱去肽片段5树脂上的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，将肽片段2与肽片段5树脂偶联，得到肽片段6树脂；脱去肽片段6树脂上的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，将肽片段1与肽片段6树脂偶联，得到利拉鲁肽主链肽树脂；

3)脱去利拉鲁肽主链肽树脂第20位的赖氨酸侧链保护，并连接侧链得到利拉鲁肽肽树脂；

4)在裂解液的作用下，裂解利拉鲁肽肽树脂得到利拉鲁肽粗肽；利拉鲁肽粗肽经纯化、冻干，得到利拉鲁肽；

其中，步骤1)固相合成肽片段使用的树脂为2-氯三苯甲基氯树脂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)使用树脂的替代度为0.3～0.8mmol/g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)固相合成肽片段选用的缩合剂与活化剂的组合为DIC与HOBt的混合物、DIEA与TBTU的混合物或DIEA与HATU的混合物，缩合剂与活化剂的摩尔比为1.5～2.0:1，使用的溶剂为DMF，脱Fmoc保护液为体积百分比为20％哌啶的DMF溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的裂解液为体积百分比为1％TFA的DCM溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述偶联选用的缩合剂与活化剂的组合为DIC与HOBt的混合物、DIEA与TBTU的混合物，缩合剂与活化剂的摩尔比为1.0～1.5:1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的脱去赖氨酸侧链Dde保护的试剂为水合肼与DMF的混合物，二者的体积比为1:(10～13)。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的裂解试剂为TFA、EDT、PhSMe、TIS与H2O的混合物；上述TFA、EDT、PhSMe、TIS与H2O的体积比为(80～85):(3～6):(3～5):(1～2):(2～4)。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的纯化步骤包括反相高效液相色谱纯化和调节等电点析出、沉降。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Asp(Otbu)-OH与替代度为0.4～0.6mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂偶联后，脱去Fmoc保护基得到Gly-树脂载体，然后加入DIEA/TBTU，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tbu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Ala-OH、BOC-His(trt)-OH，得到肽片段1树脂BOC-His(trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-树脂；在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Leu-OH与替代度为0.4～0.6mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂偶联后，脱去Fmoc保护基得到Leu-树脂载体，然后加入DIEA/TBTU，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Val-OH，得到肽片段2树脂Fmoc-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-树脂；在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Ile-OH与替代度为0.4～0.6mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂偶联后，脱去Fmoc保护基得到Ile-树脂载体，然后加入DIEA/TBTU，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH，得到肽片段3树脂Fmoc-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Dde)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-树脂；在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Gly-OH与替代度为0.4～0.6mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂偶联后，脱去Fmoc保护基得到Gly-树脂载体，然后加入DIEA/TBTU，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Ala-OH，得到肽片段4树脂Fmoc-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；

2)使用体积百分比为1％TFA的DCM溶液作为裂解试剂，分别对肽片段1、2、3树脂进行裂解，得到全保护的肽片段1、肽片段2、肽片段3；使用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱去肽片段4树脂上的氨基保护基，将肽片段3以DIC与HOBt的混合物活化后，加入到上述树脂的DMF溶液中，反应得到肽片段5树脂；使用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱去肽片段5树脂上的氨基保护基，将肽片段2以DIC与HOBt的混合物活化后，加入到上述树脂的DMF溶液中，反应得到肽片段6树脂；使用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱去肽片段6树脂上的氨基保护基，将肽片段1以DIC与HOBt的混合物活化后，加入到上述树脂的DMF溶液中，反应得到利拉鲁肽主链肽树脂；

3)使用体积比为1:13的水合肼与DMF混合溶液，脱去利拉鲁肽主链肽树脂第20位的赖氨酸的Dde保护，随后将Fmoc-Glu-OtBu与20位的赖氨酸偶联，脱去Fmoc保护后，再加入棕榈酰氯，完成侧链连接；

4)使用TFA、EDT、PhSMe、TIS与H2O体积比为85:5:4:2:4的混合溶液为裂解液，裂解利拉鲁肽肽树脂，得到利拉鲁肽粗肽；利拉鲁肽粗肽经反相高效液相色谱纯化后，调节溶液pH值至等电点，析出产品后，离心沉降，冻干，得到利拉鲁肽。