[发明专利]用于动脉粥样硬化不稳定斑块识别的超声荧光双模态纳米探针的制备方法

权利要求书

1.一种超声荧光分子探针，包括抗体以及连接于所述抗体巯基上的超声造影基团和抗体游离氨基上的发光基团，所述超声造影基团通过碳硫键和所述抗体巯基共价连接，发光基团通过酰胺键与所述抗体共价连接。

2.根据权利要求1所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述抗体上的巯基与超声造影基团上的马来酰亚胺基共价连接；所述抗体的游离α氨基与所述发光基团形成酰胺键共价连接。

3.根据权利要求2所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述马来酰亚胺基连接于聚乙二醇一端。

4.根据权利要求1-3任一项所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述超声造影基团带有负电荷。

5.根据权利要求1-3任一项所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述发光基团为菁染料。

6.一种制备权利要求1-5任一项所述的超声荧光分子探针的方法，包括：将抗体和发光基团与超声造影基团连接形成所述荧光分子探针，所述方法包括：在催化剂的存在下，分别使带有羧基的发光基团与抗体的α氨基接触，形成酰胺键共价连接；在还原剂存在下，打开抗体的二硫键，使带有马来酰亚胺基的超声造影基团与抗体的巯基接触，形成碳硫键共价连接，得到所述荧光分子探针。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述催化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)取100mg聚乳酸(PLA,MW80000)置于烧瓶中，加入3.5ml二氯甲烷、100ul全氟溴辛烷充分混匀制得油相；

(2)取20ml聚乙烯醇水溶液于烧杯中，将油相逐滴加入，置1.27cm钛合金探头下以80％输出振幅冰浴超声2min得到乳剂；

(3)将所得乳剂上覆有孔锡箔，置于磁力搅拌器上室温搅拌3～4h，使二氯甲烷充分挥发，所得液体装入10ml离心管中15℃5000g离心5min，取沉淀部分于15℃10000g5min去离子水清洗离心三次并充分分散重悬为1ml液体，马尔文粒度仪检测颗粒粒径及Zeta电位，取100ul液体冻干过夜称重定量并计算总量，冻干粉不可参与下步反应，弃之；

(4)以与聚乳酸摩尔比为1:500的比例计算所需EDC及NHS质量并称重，各取500ul MES缓冲液(pH5.5)溶解,将所得EDC溶液、NHS溶液、上步所得PLA微泡悬液加入烧瓶中，用MES缓冲液定量至5ml反应体系，室温反应1小时活化微泡表面羧基，后用1×PBS缓冲液10000g 5min离心重悬清洗3次；

(5)以与聚乳酸摩尔比为1:3的比例计算所需NH₂-PEG-mal(MW2000)的质量并称重，取500ul1×PBS溶解，将所得NH₂-PEG-mal溶液、上步所得PLA微泡悬液置于烧瓶中，用1×PBS缓冲液定量至5ml反应体系，室温搅拌过夜后置于4℃冰箱备用；

(6)取50ul Cy5.5标记的抗体(1mg/ml)加入450ul 10×PBS缓冲液，得到总液量加入等体积的TCEP(10×PBS溶解50mmol/L)室温反应30min打开抗体二硫键，得到游离巯基；

(7)将(6)步骤所得具有游离巯基的抗体用50k超滤管6000r/min 10min/次Tris缓冲液超滤2次除去TCEP；(5)步骤所得PLA-PEG-mal加入Tris缓冲液10000g 15℃5min/次离心重悬2次，与抗体置于西林瓶中锡纸包裹避光搅拌过夜，所得产物1×PBS离心重悬得到Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB；

其中荧光染料Cy5.5与抗体的连接方法如下：

1)将抗体原液(1mg/ml)50ul加入0.5ml 100k超滤管中，1×PBS补足500ul，6000g离心10分钟除去抗体储存液中的BSA，荧光染料Cy5.5，SE用DMSO溶解至浓度为1mg/ml；

2)优选Cy5.5与抗体摩尔投料比为20:1，所得F/P＝4.6:1；用50k超滤管将步骤1所得抗体超滤入碱性PB缓冲液(pH＝8.5)中，PB缓冲液补至900ul，加入14ul Cy5.5，SE(DMSO)，DMSO总量补至100ul，锡纸避光室温搅拌过夜；

3)步骤2)所得反应体系用1×PBS缓冲液50k超滤管超滤离心(6000r/min 10min)清洗，直至超滤所得废液完全无色透明。