[发明专利]一种无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法

权利要求书

1.一种无乳链球菌型特异性抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)灭火疫苗的制备：

1.1)菌液的制备：将无乳链球菌标准菌株冻干菌种用营养肉汤培养18h后，接种含7％无菌绵羊脱纤血的血琼脂平板进行划线纯化培养后，挑去典型的单菌落接种于添加2％新生牛血清和8g/L葡萄糖的THB肉汤培养基中继代5次，每次培养的时间为6小时；

1.2)灭火疫苗的制备：将1.1)中制备的菌液经离心进行浓缩，其中离心转速为4000rpm，离心时间为30min，浓缩倍数为5倍；将浓缩后的菌液以1:500(w/w)的比例向浓缩后的无乳链球菌菌液中加入甲醛溶液，于37℃灭活96h；经检验灭活完全后采用PBS洗涤2次并重悬，调整活菌数为1×10¹⁰CFU/ml；

a)添加ISA201佐剂，以1:1的比例采用磁力搅拌器搅拌配苗，搅拌时间为5min；

b)添加氢氧化铝胶佐剂，以1:3的比例充分混匀配苗；

2)灭活抗原的制备:

2.1)菌液的制备

将无乳链球菌标准菌株冻干菌种用营养肉汤培养12h后，接种含7％无菌绵羊脱纤血的血琼脂平板进行划线纯化培养后，挑去典型的单菌落接种于添加2％新生牛血清和10g/L葡萄糖的THB肉汤培养基中继代3次，每次培养的时间为5小时；

2.2)灭火抗原的制备

将2.1)制备的菌液经0.22μm的滤膜进行超滤浓缩，浓缩倍数为10倍，56℃水浴30min进行热灭活；

3)取步骤1)和步骤2)所制备的疫苗和抗原对家兔进行免疫接种；

A)基础免疫：取步骤1)制备的无乳链球菌灭活疫苗，每次以2ml的剂量皮下多点注射2次，2次的时间间隔为10d；

B)灭活疫苗强化免疫：步骤A)完成7d后，取步骤1)制备的无乳链球菌灭活疫苗皮下和腿部肌肉多点注射2次，第1次剂量为4ml，第2次剂量是第1次剂量2倍，2次的时间间隔为7d；

C)灭活抗原强化免疫：步骤B)完成7d后，取步骤2)制备的无乳链球菌灭活抗原皮下注射2次，第1次剂量为10ml，第2次剂量为第1次剂量的2倍；

4)从步骤3)最后一次免疫接种后10天的家兔体内收获血清。