[发明专利]一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法

说明书

本发明属于禽病预防疫苗制备技术领域，具体涉及一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法的专利申请。该方法包括制备新城疫病毒样颗粒、制备GM‑CSF‑GPI锚定蛋白、嵌合型新城疫病毒样颗粒组装等步骤。利用本发明所制备的嵌合型新城疫病毒样颗粒，其基于蛋白水平的修饰策略，可避免基因水平转染不稳定的缺陷，并且嵌合的蛋白可被准确定量；同时，该嵌合型新城疫病毒样颗粒可作为新型灭活疫苗应用，在免疫鸡后可诱导机体产生特异性免疫反应，有效提高免疫应答，因而具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于禽病预防疫苗制备技术领域，具体涉及一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法的专利申请。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽类为主的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，被OIE列为必报动物疫病，也是我国中长期规划五大优先防治的动物疫病之一。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在病毒学分类中属于副黏病毒科、禽副黏病毒属的一个种，即禽副黏病毒1型，是一种不分节段的单分子负链RNA病毒。新城疫病毒基因组结构模式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次编码六种结构蛋白：核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（Phosphor protein，P）、基质蛋白（Matrix protein，M）、融合蛋白（Fusion protein，F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（Large protein，L）。新城疫病毒颗粒为有囊膜的病毒粒子，呈多形性，直径约为120nm~300nm，囊膜表面覆盖有8nm长的纤突，病毒粒子内部为一直径17nm左右的卷曲核衣壳。基质蛋白M位于囊膜和核衣壳之间，既与膜结合又与核衣壳结合，是新城疫病毒粒子形成和出芽的主要驱动力。

鸡新城疫自1946年在我国首次报道至今，已在中国存在60多年，表现出一定新的临床及流行特点。流行病学数据充分证明基因VII型已经成为我国NDV流行的主要优势基因型，但也存在基因III、IX和VI型等散发，基因VII型NDV所占的比重呈逐年上升趋势。与此同时，NDV经过世界范围内四次大流行后，其宿主范围也不断扩大，迄今能自然或人工感染的禽类已超过250多种。过去认为，NDV一般不对鸭、鹅等水禽有致病性，而近十几年，在鸭群、鹅群中常见新城疫的暴发与流行。大量流行病学调查数据显示，当前我国NDV的优势流行株属于基因VII型，而目前国内普遍使用的疫苗LaSota为基因II型，虽然它们同属一个血清型，但在遗传距离上相差较远，对当前NDV强株的攻击并不能提供理想的免疫保护效力。目前常用的生产活疫苗的毒株有Mukteswar株（I系苗）、Hitchner B1株（II系苗）、F株（III系苗）、LaSota株（IV系苗）以及V4弱毒苗。其中I系苗为中等毒力型，II、III、IV系疫苗毒力较弱。弱毒苗可大规模饮水、喷雾和气雾免疫，能刺激黏膜免疫，而且疫苗毒可以从免疫禽传播给未免疫禽。其不足之处在于污染环境，并且有毒力返强可能，在机体抵抗力下降时，可能引起发病。生产灭活苗的毒种一般包括LaSota、Ulster等，实际生产中多用来制造二联或多联疫苗。灭活苗产生抗体水平较高，持续时间较长，比较容易储存，受母源抗体影响小，免疫不良反应小；但灭活苗的灭活、乳化及免疫时需要较大剂量，所以成本较高。鉴于新城疫的流行对我国整个养禽业造成了巨大的经济损失，加紧研制有效疫苗十分有必要。

病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒，不含病毒核酸，无法自主复制，不存在基因重组或重配和毒力回复的可能，安全性高，在形态上与天然病毒颗粒相似，能够通过与病毒感染一样的途径，以接近真实构象的形式递呈给免疫细胞，更容易被机体免疫系统识别，从而有效诱导机体产生免疫保护反应。