[发明专利]一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法有效
| 申请号： | 201611182622.6 | 申请日： | 2016-12-20 |
| 公开（公告）号： | CN106636015B | 公开（公告）日： | 2019-12-10 |
| 发明（设计）人： | 丁壮;徐小洪;钱晶;丁佳欣;李金斗;黄蕾;尹仁福 | 申请（专利权）人： | 吉林大学 |
| 主分类号： | C12N7/04 | 分类号： | C12N7/04;C12N15/866;C12N15/62;A61K39/17;A61P31/14 |
| 代理公司： | 41104 郑州联科专利事务所(普通合伙) | 代理人： | 时立新 |
| 地址： | 130012 吉*** | 国省代码： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 新城疫病毒 嵌合 制备 特异性免疫反应 疫苗制备技术 蛋白水平 基因水平 免疫应答 灭活疫苗 准确定量 免疫鸡 禽病 转染 修饰 应用 蛋白 诱导 组装 预防 申请 | ||
1.一种嵌合型新城疫病毒样颗粒，其特征在于，利用GM-CSF-GPI锚定蛋白制备而成，所述GM-CSF-GPI锚定蛋白的编码碱基序列如SEQ ID NO.1所示；具体通过如下步骤制备获得：
（1）制备新城疫病毒样颗粒，具体为：
将新城疫病毒基质基因和血凝素-神经氨酸酶基因分别克隆至T载体中，分别构建重组克隆质粒pT-M和pT-HN；
对pT-M和pFastBac Dual质粒分别进行SalI-NotI双酶切，将酶切产物进行连接构建重组质粒pFastBac-M；
再将质粒pFastBac-M和pT-HN分别进行NheI-KpnI双酶切，将酶切产物进行连接，最终构建穿梭质粒pFastBac-M+HN；
将所构建的穿梭质粒pFastBac-M+HN转化DH10 Bac感受态细胞中，获得重组杆粒rBacmid-M+HN；
将重组杆粒rBacmid-M+HN转染昆虫Sf 9细胞后得到重组杆状病毒rBV-M+HN，经培育并纯化处理后，得到新城疫病毒样颗粒；
（2）制备GM-CSF-GPI锚定蛋白，具体为：
人工合成如SEQ ID NO.1所示融合序列，将该融合序列与pFastBac1进行连接构建穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI；
将穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI转化至DH10 Bac感受态细胞中，筛选获得重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI；
将重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI转染昆虫Sf9细胞后得到重组杆状病毒rBV-GM-CSF-GPI，经培育并纯化处理后，得到GM-CSF-GPI锚定蛋白；
（3）制备嵌合型新城疫病毒样颗粒，具体为：
将步骤（1）中制备所得新城疫病毒样颗粒和步骤（2）制备所得GM-CSF-GPI锚定蛋白，混合均匀后进行孵育，孵育结束后离心，收集沉淀即为嵌合型新城疫病毒样颗粒。
2.权利要求1所述新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）制备新城疫病毒样颗粒，具体为：
将新城疫病毒基质基因和血凝素-神经氨酸酶基因分别克隆至T载体中，分别构建重组克隆质粒pT-M和pT-HN；
对pT-M和pFastBac Dual质粒分别进行SalI-NotI双酶切，将酶切产物进行连接构建重组质粒pFastBac-M；
再将质粒pFastBac-M和pT-HN分别进行NheI-KpnI双酶切，将酶切产物进行连接，最终构建穿梭质粒pFastBac-M+HN；
将所构建的穿梭质粒pFastBac-M+HN转化DH10 Bac感受态细胞中，获得重组杆粒rBacmid-M+HN；
将重组杆粒rBacmid-M+HN转染昆虫Sf 9细胞后得到重组杆状病毒rBV-M+HN，经培育并纯化处理后，得到新城疫病毒样颗粒；
（2）制备GM-CSF-GPI锚定蛋白，具体为：
人工合成如SEQ ID NO.1所示融合序列，将该融合序列与pFastBac1进行连接构建穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI；
将穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI转化至DH10 Bac感受态细胞中，筛选获得重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI；
将重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI转染昆虫Sf9细胞后得到重组杆状病毒rBV-GM-CSF-GPI，经培育并纯化处理后，得到GM-CSF-GPI锚定蛋白；
（3）制备嵌合型新城疫病毒样颗粒，具体为：
将步骤（1）中制备所得新城疫病毒样颗粒和步骤（2）制备所得GM-CSF-GPI锚定蛋白，混合均匀后进行孵育，孵育结束后离心，收集沉淀即为嵌合型新城疫病毒样颗粒。
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