[发明专利]一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法

说明书

本发明涉及一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，包括如下步骤：(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗，用剪刀剪碎至1mm²组织块，取适量组织块至分离液中，用吸管吹打、过滤，滤液离心，得黄色沉淀；(2)取黄色沉淀，加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基中，吹打均匀后接种至培养板，于CO₂细胞培养箱中培养。本发明的方法可以稳定培养中华绒螯蟹肝胰腺细胞至72h存活率高于50％，为后续细胞系的建立提供理论依据，为细胞毒理、基因工程等相关领域研究提供细胞工具。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体地说，是一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法。

背景技术

中华绒螯蟹(Eriocheir)属甲壳纲十足目，是我国水产养殖产业的主要养殖品种之一。随着养殖规模扩大，养殖年份增加，各类疾病，尤其是一些病毒病的爆发对中华绒螯蟹养殖产业造成了巨大影响。肝胰腺是蟹类重要的组织器官，肩负着许多生理功能，其中包括合成并分泌消化酶、吸收营养物质、存储无机物，代谢糖类物质，除此之外肝胰腺还参与排泄与蜕皮等生理活动。肝胰腺由多种细胞构成，根据细胞形态和功能可以分为四种，即胚细胞(E细胞)、分泌细胞(B细胞)、吸收细胞(F细胞)、储存细胞(R细胞)。其中R细胞主要形式储存功能，R细胞的胞质中具有圆形的小液泡，近圆形的细胞核靠近细胞基部，部分细胞具有大小不一的双核，两核或紧贴或分开。R细胞中具有大量的粗面内质网和噬碱性强的脂滴，胞质中游离核糖体的数量同样非常之多，除此之外还分布有少量的线粒体和一些小液泡。R细胞发达的脂肪体使其具有储藏功能，储存着河蟹生活必需的能量来源。

中国期刊《动物学杂志》2012年2月公开的论文《中华绒螯蟹血细胞原代培养条件的优化》，比较了几种常见血细胞培养基(L-15、2×L-15、3×L-15、M199和RMPI-1640)对中华绒螯蟹血细胞原代培养中细胞形态以及存活率的影响，在筛选获得的最佳培养基中添加不同比例胎牛血清，进一步观察血清对中华绒螯蟹血细胞培养效果的比较。河北大学2009年公开的硕士论文《中华绒螯蟹雄性生殖细胞体外培养的研究》，以中华绒鳌蟹雄性生殖细胞为研究对象，以细胞的贴壁率、存活率和RNA/DNA比值为生理和生化指标，分别测定了几种不同渗透压(600,700,800,900,1000,1100nunol/L)和pH值(6.5,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8)条件下体外培养雄性生殖细胞的生长状况，指出1000mmol/L为培养细胞的最适渗透压，在此渗透压条件下,培养细胞的贴壁率、存活率、RNA/DNA最大，培养细胞的适宜pH范围是7.2-7.4，在此pH条件下,细胞的贴壁率、存活率、RNA/DNA均较大。然而现有技术中，关于本发明的中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，包括如下步骤：

(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗，用剪刀剪碎至1mm²组织块，取适量组织块至分离液中，用吸管吹打、过滤，滤液离心，得黄色沉淀；

(2)取黄色沉淀，加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基中，吹打均匀后接种至培养板，于CO₂细胞培养箱中培养。

进一步，所述培养基为GIBCO公司的L-15培养基。

进一步，所述L-15培养基制备方法如下：取1L规格L-15干粉溶解于500ml蒸馏水中，在无菌环境下0.22μm滤膜过滤除菌。

进一步，所述细胞分离液为D-Hanks液。

进一步，所述中华绒螯蟹肝胰腺细胞至72h存活率高于50％。