[发明专利]一种外周血淋巴细胞连接蛋白43与IL‑2和IL‑6表达的相关性分析方法

权利要求书

1.一种外周血淋巴细胞连接蛋白43与IL-2和IL-6表达的相关性分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、大鼠血压测定

应用BP-6无创血压监测仪测量大鼠尾动脉血压，避免大鼠躁动，于大鼠清醒安静状态下连续测量3次，每次间隔至少1min，取测量3次平均值即为大鼠收缩压；

步骤2、样本采集

3％戊巴比妥钠麻醉大鼠，乙二胺四乙酸抗凝管采集腹主动脉外周血5ml，1 500r/min离心5min，取血浆于-20℃保存，离心后的下层血细胞用于分离外周血淋巴细胞；

步骤3、炎性因子IL-2和IL-6表达

取冻存于-20℃的血浆样品，ELISA法检测IL-2和IL-6表达水平，操作严格按照试剂盒说明书进行；

步骤4、淋巴细胞分离

将血细胞与0.9％氯化钠溶液1:1等体积稀释，吹打混匀；取无菌15ml离心管，加入淋巴细胞分离液，将细胞悬液缓慢按照1:1比例加到淋巴细胞分离液上层，保证血液置于淋巴细胞分离液上层；根据密度梯度离心法分离淋巴细胞，低速离心机水平离心30min，1 500r/min，缓升缓降；将分离的白色浑浊淋巴细胞层吸出至无菌15ml离心管内，加入3倍0.9％氯化钠溶液洗涤，以1 800r/min离心6min；洗涤2次，弃上清，沉淀即淋巴细胞；加入1ml培养基重悬，吸取50μl到1.5ml离心管，加450μl磷酸盐缓冲液稀释10倍，显微镜下计数并用台盼蓝染色观察细胞活性；细胞活性为95％以上，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，将细胞接种在24孔板中；

步骤5、流式细胞术检测CD₄⁺和CD₈⁺T细胞Cx43表达收集5×10⁵个细胞于EP管内，100μl PBS重悬细胞，分别加入相应流式抗体1μl，CD₄-APC，APC同型对照；CD₈-PE，PE同型对照，并设立阴性对照；125μl固定剂固定淋巴细胞，4℃孵育20min，Cx43一抗1μl抗体与99μl 1×破膜剂破膜，37℃孵育20min；FITC二抗1μl，37℃孵育20min；1ml 1×破膜剂洗涤，弃上清液，PBS重悬细胞，流式细胞仪检测，流式CELLQuest软件进行分析；

步骤6、实时荧光定量PCR检测IL-2mRNA和IL-6mRNA表达计数分离出的淋巴细胞，调整培养基至细胞浓度为1×10⁶个/ml；将淋巴细胞分为空白对照组、刀豆蛋白组和Gap27+ConA组；加入10％自体血清，血清处理步骤：56℃灭活30min，以4 000r/min离心30min，4℃保存，于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h；

TRIzol法提取上述培养的淋巴细胞mRNA，核酸蛋白含量检测仪测定A₂₆₀/A₂₈₀值，1％甲醛变性凝胶电泳检测提取质量；选用GADPH作为内参基因，根据大鼠IL-2、IL-6基因cDNA序列，设定引物序列；将提取的mRNA样品、随机引物、Rtmix、dNTP混合液、焦碳酸二乙酯水按照反转录体系配制反应体系，按照37℃反转录60min，90℃灭活反转录酶5min的反应程序进行反转录合成cDNA；将2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix，10×miScript Nucleics Mix通用引物，模板cDNA和RNase-Free water置于冰上，并轻轻混匀，配制反应体系，按照95℃预变性2min，1个循环；95℃变性5s，60℃退火加延伸10s，40个循环设置Bio-Rad荧光定量PCR仪，记录IL-2mRNA与IL-6mRNA相对表达量；

Gap27使淋巴细胞炎性因子IL-2mRNA和IL-6mRNA表达下调，提示缝隙连接阻断剂通过改变Cx43通道结构或抑制细胞内Ca2+浓度进而改变通道通透性，从而影响细胞因子的释放。