[发明专利]藻类培养中臂尾轮虫的快速定量检测qPCR方法

权利要求书

1.一组引物组，其特征在于，包含三对引物，分别用于特异性扩增序列SEQ ID No.1-3，各对的上下游引物序列如下：

（1）上游引物CoI-1F：5’- CAGCAATTTTATTAATTACTAGG -3’；

下游引物CoI-1R：5’- ATAATACAGGATTGCCTCCAC -3’；

（2）上游引物CoI-2F：5’- CGGCTTAATTGGTCTTAGCATA -3’；

下游引物CoI-2R：5’- CCTAACATAAGTGGAATAAGTCA -3’；

（3）上游引物CoI-3F：5’- TCTTCCGCTATTGATGCTG -3’；

下游引物CoI-3R：5’- ACGGTCTAACGAGATTCTTT-3’。

2.权利要求1所述的引物组在藻类培养中臂尾轮虫的快速定量检测qPCR方法中的应用。

3.一种藻类培养中臂尾轮虫的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，采用权利要求1所述的引物组的各对引物，将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒PGEM-T中，构建重组质粒作为检测臂尾轮虫浓度的定量阳性标准品，采用权利要求1所述引物组中的任意一段引物，对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测，检测结果的判断方法如下：

（1）阳性对照的Ct值应小于33.0，阴性对照的Ct值应大于36.0，定量阳性标准品为重组质粒，阴性对照为无菌双蒸水；

（2）若检测样品的Ct值小于33.0，且呈现典型的扩增曲线，则判定为阳性结果，表明检测样品中含有臂尾轮虫；

（3）若检测样品的Ct值大于36.0或无扩增信号，则判定为阴性结果，表明检测样品中无臂尾轮虫；

（4）若Ct值在33.0～36.0之间，则视为可疑结果，样品需重复检验一次；

若结果仍在此范围内，则判定为阴性结果；

结果呈阳性的样品，根据其Ct值以及建立的定量标准曲线计算样品内的臂尾轮虫含量。

4.根据权利要求3所述的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，所述引物组中各上游引物和下游引物的浓度均为10 μ mol/L，反应终浓度为0.25μ mol/L。

5.根据权利要求3所述的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR采用的荧光染料为SYBR Green 染料，荧光检测波长为470-514 nm。

6.根据权利要求3所述的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系为： 2×的LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master 10μL，10μ mol/L的上游引物0.5μL，10μ mol/L的下游引物0.5μL，DNA模板1μL，加水至总体积20μL。

7.根据权利要求3所述的快速定量检测qPCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃ 5min，1个循环；95℃ 10s、56℃ 20s、72℃ 30s，40个循环。

8.一种qPCR试剂盒，其包括权利要求1所述的引物组。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：包括检测试剂和基因组DNA提取试剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述检测试剂包括荧光染料、权利要求3所述的阳性标准品。

11.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述基因组DNA提取试剂包括Roche 的High Pure Template Preparation Kit试剂盒。