[发明专利]一种三唑磷定性定量分析的方法及该方法所用的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全检测免疫分析技术领域，具体而言，涉及一种三唑磷定性定量分析的方法及该方法所用的试剂盒。

背景技术

随着高毒农药品种将逐步从市场退出，三唑磷已成为替代甲胺磷农药的主要品种，广泛用于长江中下游流域水稻二化螟的防治。近年来其使用量迅速增加，在三唑磷农药在我国正进入市场旺季的同时，国外已经开始限制或禁止三唑磷农药的使用与销售。2004年11月28日，国家质检总局发布紧急预警，称欧盟于12月31日起正式禁止320种农药在欧盟销售。其中涉及中国正在生产、使用以及出口的农药达60多个品种，其中就包括了三唑磷农药。其他家和地区对三唑磷的最大残留限量也提出了越来越严格的标准：日本规定稻米中三唑磷的最大残留限量(MRL)为不得检出；欧盟除茶叶为0.05mg/kg、棉籽0.1mg/kg外，其余样品为0.02mg/kg；我国三唑磷的最大残留限量一般都限定为0.05mg/kg。因此，加强三唑磷检测方法学研究对于保障我国食品安全和农产品贸易具有重要意义。

免疫分析方法的作用和地位目前已得到国内外学者的广泛认可，免疫分析方法的研究也是检测方法研究最热门的领域之一。在免疫分析方法领域中，我国在酶联免疫分析方法方面开展了较为深入的研究，包括半抗原合成、抗体制备、标记物偶联、反应体系中各种理化性质对免疫分析方法的影响及半抗原结构与其所制备得到抗体之间的构效关系等方面。近年来，我国学者在荧光免疫分析、化学发光免疫分析、生物传感器和生物条形码免疫分析方法方面也开展了较多的研究工作。

生物条形码分析方法近十年来在痕量蛋白质和核酸检测方法得到了快速的发展，通过与免疫反应相结合建立的生物条形码免疫分析方法，将免疫分析方法的检测限提高到了一个新的高度。然而该方法建立至今，只能通过构建“三明治”结构模式实现对蛋白质等大分子物质的检测。由于小分子化合物通常情况下只有一个抗原结合位点，因此目前生物条形码免疫分析方法采用的“三明治”结构模式基本不能适用于农兽药或生物毒素等小分子物质的检测。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三唑磷生物条形码免疫分析测定试剂盒，使用该试剂盒与实施定量PCR联用，可以特异地定量检测水中或食品中三唑磷含量。该试剂盒通过竞争反应体系进行检测，克服了目前生物条形码免疫分析方法采用的“三明治”结构模式基本不能适用于三唑磷的检测的缺陷。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种三唑磷生物条形码免疫分析测定试剂盒，所述试剂盒包含有：

三唑磷标准品、三唑磷纳米探针、三唑磷双标胶体金纳米探针；

所述三唑磷纳米探针由磁性纳米粒子和三唑磷完全抗原偶联而成；

所述三唑磷双标胶体金纳米探针由抗三唑磷抗体和双链DNA包被胶体金颗粒得到；

所述双链DNA由硫醇修饰的单链DNA和条形码单链DNA互补配对而成。

三唑磷(Triazophos)分子式：C₁₂H₁₆N₃O₃PS；CAS号：24017-47-8。

本发明通过改变生物条形码免疫分析方法的现有反应模式，建立基于小分子竞争反应模式的生物条形码免疫分析方法。通过将农药小分子半抗原与载体蛋白的偶联物包被于磁性纳米粒子表面，并于胶体金纳米探针表面结合农药抗体和起信号放大作用的生物条形码，利用磁性纳米粒子表面的包被抗原与农药分子竞争结合胶体金纳米探针表面的抗体建立竞争型免疫化学反应体系。

本发明通过改变生物条形码免疫分析方法的现有反应模式，建立基于小分子竞争反应模式的生物条形码免疫分析方法。通过将三唑磷与载体蛋白的偶联物包被于磁性纳米粒子表面制备三唑磷纳米探针，并于胶体金纳米探针表面结合农药抗体和起信号放大作用的生物条形码用以制备三唑磷双标胶体金纳米探针，利用磁性纳米粒子表面的包被抗原与农药分子竞争结合胶体金纳米探针表面的抗体建立竞争型免疫化学反应体系。利用磁分离系统分离免疫结合的抗原抗体复合物，采用热变性技术促使胶体金纳米探针释放生物条形码，并利用荧光定量PCR技术生物条形码含量，实现对三唑磷农药的定量检测。

该试剂盒的使用效果具有简便、快速、灵敏、特异、稳定等优点。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，特别适合广大的质检机构推广使用，为食品安全检测提供一种非常有价值的检测手段。