[发明专利]一种改进的ARMS引物结构(Super-ARMS)及其使用方法

说明书

本发明公开了一种改进的ARMS引物结构(Super‑ARMS)及其使用方法，包括：正向特异引物，它包括如下三部分：1)第一序列，其长度为18‑40个碱基，其中3′末端第1位碱基为突变位置，3′末端第2‑4位有一错配碱基，其余碱基和待测序列互补；2)第二序列，其长度为6‑20个碱基，其和第一序列3′端序列互补；3)spacer,其连接第一序列的5′末端和第二序列的3′末端；反向通用引物，其长度为15‑40个碱基，和待测序列的另一条链互补；其中，所述的反向引物的Tm值比正向引物的第一序列的Tm值低3‑8℃。本发明能够提高ARMS的特异性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种改进的ARMS引物结构(在本发明以下内容中简称为Super-ARMS)及其使用方法。

背景技术

ARMS技术是一种在PCR基础上发展起来用于检测DNA点突变的新方法，突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification,ASA)，是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。其依据的基本原理是：Taq DNA聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，因此对于3′末端错配的引物，以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，3′末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸，反应终止，也就得不到特异长度的扩增片段，从而表明模板DNA没有与引物3′末端相应的突变；如果PCR结果能得到特异长度的扩增片段，表明模板DNA上具有与引物3′末端相应的突变。

然而，现有的ARMS引物对有些突变的区分能力有限，检测灵敏度受限，因此，该技术在检测灵敏度等方面有待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在改进的ARMS引物结构(Super-ARMS)，以解决现有技术中存在的上述问题。

本发明提供的技术方案如下：

一种改进的ARMS引物结构(Super-ARMS)，其特征在于,包括：

正向特异引物，它包括如下三部分：

1)第一序列，其长度为15-40个碱基，3′末端第1位碱基为突变位置，3′末端第2-4位有一错配碱基，其余碱基和待测序列互补；

2)第二序列，其长度为6-20个碱基，其和第一序列互补；

3)spacer,其连接第一序列的5′末端和第二序列的3′末端；

反向通用引物，其长度为15-40个碱基，和待测序列的另一条链互补；

其中，所述的反向通用引物的Tm值比正向引物的第一序列的Tm值低3-8℃。

本发明改进的ARMS引物结构(Super-ARMS)，在通常情况或合适条件下(例如室温)，正向引物的第一序列和第二序列结合成为双链；当引物结构与靶序列识别并杂交时，双链结合的部分被打开，两者之间以Spacer连接，引物与靶序列结合而获得DNA延伸能力。

在本发明中，所述的待测序列可以是野生型基因序列或是突变型基因序列。也即，第一序列碱基可以是与野生型基因序列完全互补，而与突变型不匹配；也可以是与突变型互补而与野生型不匹配。

作为优选，碱基的错配类型，如果3′端是“强”错配(A/G或C/T)则需要引入“弱”的错配(C/A或G/T)或不需引入错配即可阻断3′端的扩增，反之亦然；同样，当3′端是“中度”错配(A/A、C/C、G/G或T/T)则需要引入“中度”的错配。

作为优选，第一序列长度为18-30个碱基。

作为优选，第二序列长度为8-16个碱基。