[发明专利]一种来源于马粪海胆生殖腺的水溶性多糖的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及医药领域，具体涉及一种来源于马粪海胆生殖腺的水溶性多糖的制备方法及其应用。本发明具体方法为高温加热使海胆生殖腺中的酶失活，然后以低于60℃水提取多糖，提取液离心，上清液减压浓缩，依次用木瓜蛋白酶酶解和Sevage法除蛋白，水溶液经透析、醇沉、干燥得海胆总多糖，总多糖用凝胶柱色谱分离纯化得到两个多糖。本发明所用的提取温度低，不影响多糖结构和活性，提取液中杂质少，后处理方法简单，极大地降低了生产成本。所得总多糖性状和复溶性好，易于制备多种药物制剂。总多糖及其含有的两种多糖均有较好的抗肿瘤作用，可开发成无毒副作用的抗肿瘤药物。

技术领域

本发明涉及一种马粪海胆生殖腺多糖的制备方法及其抗肿瘤应用，属于医药技术领域。

背景技术

多糖是由单糖通过苷键聚合而成的一类高分子化合物，广泛分布于动植物及海洋生物体内，在治疗心血管疾病、抗肿瘤、抗肝炎和抗衰老等方面具有独特的生物活性，因此对糖类的研究一直十分活跃。

由于高盐、高压、低温、缺氧等特殊环境，海洋生物体内常代谢出结构独特和活性显著的物质，近年从海洋动物得到多种活性多糖类物质。海胆是棘皮动物门海胆纲生物，在我国沿海海域分布广泛，能食用的经济型海胆主要为紫海胆(Anthocidariscrassispina)、光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)和马粪海胆(Hemicentrotuspulcherrimus)等几个品种。海胆壳棘作为中药使用历史悠久，具有“软坚散结，化痰消肿，消瘰疬痰核，积痰不化，胸肋胀痛”之功效。黄色的海胆生殖腺在海胆繁殖期发育成熟，含有丰富的不饱和脂肪酸、氨基酸和微量元素等营养成分，是一种高级海洋食品资源。近年发现，海胆生殖腺含有的多糖类成分具有降血脂、抑制胃溃疡、增强机体免疫机能等多种生理活性，具有很高的药用价值。

多糖由单糖聚合而成，随着聚合程度增加，分子量增加，水溶性随之降低，升高水温可提高溶解度。目前海胆中发现的多糖的分子量多为百万级，分子聚合程度高，因此提取温度设置在80℃-100℃，以增加多糖溶解度。升高温度可提高多糖的提取效率，但提取液中的杂质增多，将影响多糖的纯化效果，也增加后期纯化工序，造成多糖的损耗。

另外，多糖是高分子化合物，同蛋白质一样存在高级结构，且与其活性密切相关，长时间加热可能会改变其高级结构，影响其生物学活性。

不同种系的海胆体内代谢产生的多糖结构不同，理化性质不同，本发明涉及的多糖是从马粪海胆生殖腺中提取和纯化得到。优化提取方法的实验结果表明，较低温度下(40-50℃)和10倍量水即达最佳提取效率(图1)，这说明马粪海胆所含多糖易溶于水，低于常规温度可实现高效提取。

平行实验比较了50℃与90℃水提多糖的各项参数，低温提取具有以下优点：

(1)提取液透明度更高，所含杂质更少，不仅简化后期纯化工序，而且低温提取减少能耗，极大的降低生产成本。

(2)低温获取的多糖提取液稳定性更好，久置无沉淀析出。经同样纯化方法所得多糖为白色粉末，常温下易溶于水，利于进一步纯化和生物学活性筛选实验。

(3)多糖产品的水溶性好，水溶液稳定，不仅具有更好的生物利用度，也有利于后期药物不同剂型的设计与开发。

(4)低温获取的总多糖及其经柱色谱分离纯化得到的两个多糖对肿瘤细胞BEL-7402、Panc-28、U20S、HepG2、SGC7901和THP-1均有不同程度的抑制作用(图3-图8)，而90℃提取得到的总多糖对上述细胞未表现出抑制活性。

在发现马粪海胆所含多糖常温下易溶于水的基础上，本发明系统性筛选并确定了一种海胆多糖的高效、低成本的提取和纯化方法，与高温水提多糖相比，本发明所得多糖具有更好的水溶性、稳定性及抗肿瘤活性。目前国内外鲜有探讨提取温度对多糖活性影响的研究。

发明内容