[发明专利]一种基于发光量子点纳米微乳探针检测样品中角质蛋白19片段与癌胚抗原含量的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体地，涉及一种基于发光量子点纳米微乳探针检测样品中角质蛋白19片段与癌胚抗原含量的试剂盒。

背景技术

细胞角质蛋白19片段 （CYFRA 21-1）分子量约为30KDa。生理状况下，细胞角质蛋白19广泛表达在多种组织细胞表面，常见于鳞状上皮和层状上皮细胞。在上皮细胞恶性癌变的进程中，激活的蛋白酶系统加速了细胞的降解，大量的细胞角质蛋白片段随之释放进入血液循环系统。由于该可溶性片段可与两株单克隆抗体KS 19.1和BM 19.21特异性结合，故称为CYFRA 21-1。CYFRA21-1目前被认为是一种主要用于检测肺癌的肿瘤标记物。

癌胚抗原 (CEA) 是一种糖蛋白复合物，分子量约为220KDa左右，它是由加拿大科学家Samuel O. Freedman和Phil Gold于1965年在结肠癌组织提取物当中首次发现。通常而言，癌胚抗原是在胎儿时期，由胃肠道组织、胰和肝脏细胞合成，并在出生后基本停止合成。因此正常健康个体的血清当中癌胚抗原的含量维持在很低的水平，约为2.5 µg/mL。通常认为，血清中CEA水平的升高在胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌患者当中较为常见，也常见于一些非肿瘤性疾病当中，比如溃疡性结肠炎、胰腺炎、肝硬化、慢性阻塞性肺病、克罗恩病等。因此，血清当中CEA含量的检测对上述疾病的诊断与治疗具有重要的价值。

肺癌是常见的恶性肿瘤，是难治的实体瘤之一，死亡率在各类恶性肿瘤中居首位，发病率呈逐年上升趋势。其5年生存率仅为13%，而当中将近60%的患者由于发现得较晚，已经不能进行手术治疗，大部分腺癌对化疗、放疗不敏感。提高肺癌患者生存的主要手段是早期诊断，早期治疗。血清肿瘤标志物的异常往往早于影像学的异常,对于无临床相关症状患者，任何一项标志物的异常都可能具有提示意义。因此，多个肿瘤标志物的同步联合检测具有非常重要的临床意义。

目前常规的肿瘤标志物的免疫学检测大多采用酶免疫分析、化学发光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）等。酶联免疫法试剂盒为定性或半定量试剂，不能为临床医生提供精确的定量，很难有效指导临床的治疗。化学发光免疫分析与其它标记技术相比有许多优点：①无放射性辐射的危害；②灵敏度高，检测线性范围宽；③稳定性好、自动化程度高；④应用范围宽，可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可以用于核酸探针的检测。缺点是发光过程短、样品不能重复检测、本底较高及易受环境物质干扰。目前国内使用大部分为Roche、Abbott、Beckman为代表的进口试剂。TRFIA技术是继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑，已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。TRFIA以稀土离子作为标记物，具有制备简便、储存时间长、无放射性污染、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点。然而，目前国内外厂家均采用基于微孔板TRFIA技术，由于微孔板的固液相反应面积小，需要的免疫反应时间较久；微孔板包被抗体或抗原是通过物理吸附包被，包被抗体或抗原很难标准化，使得检测结果精密度较差；微孔板TRFIA技术主要为半自动检测，或前处理加上TRFIA检测仪的准全自动检测，使得样本需要积累到一定量后才能检测。

免疫侧向流 （LFIA）是一种将免疫检测与层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。其原理在于，以纤维素硝酸酯薄膜为固相载体，样品在毛细作用下在测试条上泳动，样品中的待测分子与膜上的特异性抗体结合，最终形成抗体-抗原-抗体的三文治样免疫复合物。通过一定的检测手段，可以测得膜上的信号，从而对样品中待测物进行定性或定量分析。该检测方法与传统免疫学检测方法相比，有着明显的优势：1.检测快速。通常而言，LFIA检测只需15到30分钟，即可完成整个检测过程，因为LFIA把样品的预处理、加样、免疫反应等步骤整合在一起。2.检测方便。一般LFIA检测信号的仪器都较为轻便，方便家庭或灾害现场使用。3.无需特殊技术培训。对于LFIA，操作人员只需完成一个步骤即可：加样-检测。因此特别适合家庭或社区用于疾病的检查。

传统的免疫侧向流，是使用胶体金作标记物，并对结果用肉眼进行判断，通常只能作定性或半定量检测，而且通常一次只能检测一项抗原分子。随着技术的进步，近年来也有使用荧光物质作标记物的LFIA。而一般的荧光物质，有着荧光信号较弱，容易被光漂白，不易于保存等弱点。

发明内容