[发明专利]利用PCR-SSCP检测绵羊FTH-1基因插入缺失多态性的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种利用PCR‑SSCP检测绵羊FTH‑1基因插入缺失多态性的方法及其应用：以包含FTH‑1基因的待测绵羊全基因组DNA为模板，PCR扩增绵羊FTH‑1基因片段，利用SSCP技术对PCR产物进行检测分型；根据电泳结果鉴定绵羊FTH‑1基因第639位插入缺失多态性。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与绵羊的繁殖性能密切相关的分子遗传标记的方法，以用于绵羊的辅助选择和分子育种，加快绵羊良种繁育速度。

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以绵羊功能基因的插入缺失(indels)作为分子遗传标记，特别涉及小尾寒羊和湖羊绵羊FTH-1基因的4bp插入缺失(indels)多态性及其检测方法。

背景技术

在绵羊育种中，人们期望通过对繁殖性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

分子育种，即分子标记辅助选择育种(Molecular Mark-Assist Selection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。

基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。

插入缺失(Indels，insertion-deletions)标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。由于大多数情况下无法获得祖先序列，所以一般不能判断空位位点上哪些序列发生了插入，哪些序列发生了缺失，故统称为增减。由于这种类型的突变导致了更为严重的序列改变，对基因功能所产生的影响要大于因核苷酸替换而引起的影响。在以单基因为主的分子进化和系统发生研究中，通常忽略了序列的插入和缺失，即不考虑比对后的空位位点。近年来，随着基因组数据的大量涌现，插入和缺失变异开始受到了越来越多的关注。目前，尽管对indels研究还不够深入，但对其变异的研究已经涵盖了其发生频率、大小、分布模式、序列进化模型及应用等各个方面。现有的研究结果表明，基因组中出现的indels多位于非编码序列中，长度大小是可变的，插入和缺失发生的比例在不同类群的生物中不同，并与基因组大小具有相关性。人类基因组中已经确定了415,436个indels多态性位点，长度在1～9989bp之间变化，以平均每7.2kb有一个indels的密度分布在整个基因组中，其中148,000(35.7％)个indels位于已知基因序列中，5,542个indels位于启动子和外显子序列中。它们被分为5种：第一类是单碱基对的插入或缺失；第二类是仅单碱基对的扩增；第三类是2～15bp重复单位的多碱基对的扩增；第四类是转座子插入；第五类是随机DNA序列的插入或缺失。

目前，主要采用几种不同的路线来发现基因组上的多态性：即DNA序列测定方法、等位特异性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些遗传多样性检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的检测方法，但是，其检测费用昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。