[发明专利]一种微卫星引物及用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱及方法

权利要求书

1.一种微卫星引物，其特征在于：其源于许氏平鲉，该引物（HJ5-132）的序列为：

F: CCCTCCTCTTCCATCTGT

R: ACCCTGAATGAGTTACCG。

2.一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱，其特征在于通过如下步骤实现：

1）选取能完全识别其种类的成熟的许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉各60个，剪取每个个体少量鱼鳍分别充分剪碎，，用干净的滤纸吸除水分，分别放入1.5mL离心管中，再加入400μl裂解液和10μl浓度为10mg/ml蛋白酶K，在振荡器上混匀，55℃水浴消化3～5 h，直到裂解液澄清为止；

2）分别在离心管中加入200μL饱和酚、200μL24:1的氯仿/异戊醇混合液抽提三次；

3）分别用600μL的无水乙醇沉淀DNA，经70%酒精洗涤，室温晾干后溶于50μL的超纯水中；

4）紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，若完整性符合要求则；

5）以提取的三个物种基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应：PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50 ng，Buffer 10 mM，引物各 0.2 mM，dNTP 0.2 mM，Mg2⁺ 2.0 mM，Taq DNA聚合酶 1U，用灭菌水补足25μL；所述的引物为权利要求1所述的序列；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min；

6）PCR反应结束后，取0.2μL扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，22 V稳压电泳4小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入0.1%AgNO₃溶液染色10min；染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液显色，直至条带清晰为止，分别得到许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉的图谱，将三种图谱合并形成如附图所示的标准图谱。

3.根据权利要求2所述的一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱，其特征在于：所述的AgNO₃溶液为比例为1g AgNO₃ 在1000mL dH₂O 的溶液；所述的显色液为2%NaOH、0.4%甲醛、0.2%NaS₂O₃、dH₂O 1000mL的混合溶液。

4.一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的方法，其特征在于包含如下步骤：

a）剪下少许待鉴鲉的鱼鳍，按照权利要求2步骤1）-4）的酚氯仿抽提法提取待鉴别鲉鱼个体的基因组DNA；

b）对提取的基因组DNA进行如权利要求2步骤5）的PCR扩增，得到扩增产物；

c）将扩增产物进行如权利要求2步骤6）的聚丙烯凝胶电泳及染色，得到对比图谱；

d）将对比图谱与权利要求2得到的标准图谱进行对比，若

在305bp～330bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为许氏平鲉，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；

若在286bp～295bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为朝鲜平鲉，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；

若在252bp～270bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为褐菖鲉，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子。