[发明专利]一种高产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种高产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明在产肝素前体的枯草芽孢杆菌中，共表达了UDP‑GlcUA途径和UDP‑GlcNAc途径中的关键酶基因，获得了肝素前体产量及分子量均增大的重组菌株。当共表达tuaD，gtaB，glmU，glmM和glmS基因，摇瓶中肝素前体产量提高至2.89g/L，分子量为75.90kDa。通过在3L发酵罐中进行补料分批发酵，肝素前体的产量最终积累到7.25g/L，分子量为46.66kDa。本发明为工业化生产肝素奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种高产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

肝素(Heparin)和硫酸乙酰肝素(HS)属于一类高度硫酸化的糖胺聚糖(GAGs)，糖胺聚糖是一类由重复的二糖单元组成的不分支的带负电荷的多糖，由于其独特的生理功能，糖胺聚糖组成了一类具有巨大治疗应用潜力的化合物。肝素作为一种抗凝血和抗血栓药物，在深部静脉血栓形成、肾透析和留置导管分流术、及术后血栓控制等医疗措施中使用。同时还具有抗血脂，抗炎、抗肿瘤、抑制细菌粘附等作用，自1918年被发现后被广泛应用于临床作为抗凝血药物。其结构复杂、生物活性多样等特点，研发以肝素和硫酸乙酰肝素为骨架的新药已成为近年来多糖药物研究的热点。

肝素主要通过动物提取法获得，然而该方法存在种间疾病感染和过硫酸软骨素污染等风险，且提取过程往往造成环境污染。另外，通过化学法也可从头合成低分子量的肝素，但因原料昂贵、步骤繁多和产量极低等缺点难以进行大规模制备。近年来，以肝素前体为合成起点进行硫酸化的化学酶法逐渐受到研究者的重视，因此，在微生物中实现肝素前体的高产成为了重要环节。

发明内容

本发明提供了一种高产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌，是在枯草芽孢杆菌B.subtilis 168基因组整合表达KfiC和KfiA基因的基础上，以pP43NMK为表达载体共表达肝素前体合成途径的关键酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述共表达是指共表达UDP-GlcUA途径的关键酶基因pgcA、gtaB、tuaD，或共表达UDP-GlcNAc途径的关键酶基因glmS、glmM、glmU。

在本发明的一种实施方式中，所述共表达是指组合共表达，所述组合共表达是共表达tuaD和glmU，或共表达tuaD、glmU、gtaB、glmM、glmS。。

本发明的第二个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，是以整合共表达KfiC和KfiA基因的B.subtilis 168为宿主，以pP43NMK为表达载体共表达肝素前体合成途径的关键酶基因；所述共表达是指共表达UDP-GlcUA途径的关键酶基因pgcA、gtaB、tuaD，或共表达UDP-GlcNAc途径的关键酶基因glmS、glmM、glmU。

在本发明的一种实施方式中，所述共表达是指组合共表达，所述组合共表达是共表达tuaD和glmU，或共表达tuaD，gtaB，glmU，glmM和glmS。

本发明的第三个目的是提供一种发酵生产肝素前体的方法，所述方法是将所述重组菌接种至发酵培养基中，在37℃下培养24～60h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基以蔗糖为碳源。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的组成成为分：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，3.9g/L硫酸钾，1.5g/L硫酸镁，50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5-7.5。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的组成成为分：20g/L酵母粉，15g/L蔗糖，3.9g/L硫酸钾，1.5g/L硫酸镁，50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5-7.5。

本发明还提供所述重组枯草芽孢杆菌在医药、保健品领域的应用，所述应用具体是制备含肝素的药品、医药配制品。