[发明专利]一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及生物学技术领域，具体涉及一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法。

背景技术

蜱类是一种专性、非永久性寄生于陆生脊椎动物的医学节肢动物，可通过直接叮咬和释放毒素或携带病原体对宿主造成伤害。在进出境口岸蜱种类的调查中，对蜱虫的鉴定及进化分型具有重要意义。目前，我国对于蜱种的鉴定主要依靠形态学方法，还没有简单、稳定的分子生物学手段。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷及不足，本发明提供了一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法，能够在低DNA模板浓度下快速、稳定的鉴定蜱虫的种类。

本发明采用的技术解决方案是：一种蜱虫巢式PCR特异性引物，包括设计的两对特异性引物，具体为：

T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；

T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；

T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；

T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。

一种蜱虫巢式PCR鉴定方法，包括以下步骤：

(1)将需要检测的蜱虫样品进行形态学上初步分型；

(2)将经过形态学初步分型鉴定处理后的蜱虫样品，每种各取一只，进行基因组提取DNA，蜱虫样品无需RNA酶处理；

(3)以蜱虫样品基因组DNA为模板，以所述的T18sF1+T18sR1为第一套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、双蒸水，进行第一轮PCR；

(4)以第一轮PCR产物DNA为模板，分别以所述的T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1为第二套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、双蒸水，进行第二轮PCR；

(5)取第二轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

(6)将第二轮PCR产物进行序列测定；

(7)根据NCBI数据库中记载的蜱虫18s rRNA基因序列，进行系统进化分析，最终得出蜱虫样品鉴定结果。

所述的步骤(3)中的第一轮PCR反应条件为：预热95℃，5min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 2min，共10个循环；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。

所述的步骤(4)中的第二轮PCR反应条件为：预热95℃，5min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 2min，共25个循环；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。

所述的步骤(3)中蜱虫样品基因组DNA量为2μl，第一套引物中T18sF1+T18sR1各为1μl，LAtaq酶为0.25μl，dNTP为2μl，10×Loading buffer为2.5μl，双蒸水16.25μl。

所述的步骤(4)中第一轮PCR产物DNA量为1μl，第二套引物T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1各为1μl，LAtaq酶为0.25μl，dNTP为2μl，10×Loading buffer为2.5μl，双蒸水17.25μl。

所述的步骤(5)中第二轮PCR产物量为2μl。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法，采用更为敏感的巢式PCR方法，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，通过在基因水平上进行蜱虫的分型、系统进化分析，本发明巢式PCR方法第一轮只需10个循环，第二轮需25个循环，缩短了简单的两轮普通PCR所需时间。

附图说明

图1为18s rRNA巢式PCR方法克隆示意图。

图2为温州口岸进口生牛皮中截获蜱虫形态学观察。

图3为两轮轮PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定结果。

图4为根据18s rRNA基因序列对蜱虫进行系统进化分析结果。

具体实施方式

根据蜱虫18s rRNA序列保守区设计两对特异性引物

T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；

T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；

T 18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；