[发明专利]一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法

权利要求书

1.一种蜱虫巢式PCR特异性引物，其特征在于，包括设计的两对特异性引物，具体为：

T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；

T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；

T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；

T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。

2.一种采用权利要求1所述的特异性引物的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将需要检测的蜱虫样品进行形态学上初步分型；

(2)将经过形态学初步分型鉴定处理后的蜱虫样品，每种各取一只，进行基因组提取DNA，蜱虫样品无需RNA酶处理；

(3)以蜱虫样品基因组DNA为模板，以权利要求1中所述的T18sF1+T18sR1为第一套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、双蒸水，进行第一轮PCR；

(4)以第一轮PCR产物DNA为模板，分别以权利要求1中所述的T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1为第二套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、双蒸水，进行第二轮PCR；

(5)取第二轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

(6)将第二轮PCR产物进行序列测定；

(7)根据NCBI数据库中记载的蜱虫18s rRNA基因序列，进行系统进化分析，最终得出蜱虫样品鉴定结果。

3.根据权利要求2所述的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的第一轮PCR反应条件为：

95℃预热5min；

94℃保持1min，60℃保持1min，72℃保持2min，该步骤进行共10个循环；

末次延伸至72℃，保持10min，4℃保存10min。

4.根据权利要求2所述的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的第二轮PCR反应条件为：

95℃，预热5min；

94℃保持1min，60℃保持1min，72℃保持2min，该步骤进行共25个循环；

末次延伸至72℃，保持10min，4℃保存10min。

5.根据权利要求2所述的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(3)中蜱虫样品基因组DNA量为2μl，第一套引物中T18sF1+T18sR1各为1μl，LAtaq酶为0.25μl，dNTP为2μl，10×Loadingbuffer为2.5μl，双蒸水16.25μl。

6.根据权利要求2所述的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(4)中第一轮PCR产物DNA量为1μl，第二套引物T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1各为1μl，LAtaq酶为0.25μl，dNTP为2μl，10×Loading buffer为2.5μl，双蒸水17.25μl。

7.根据权利要求2所述的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(5)中第二轮PCR产物量为2μl。