[发明专利]一种从海带中提取抗氧化肽的方法

权利要求书

1.一种海带抗氧化肽的分离方法，其特征在于：通过加入缓冲液溶解离心制备海带抗氧化肽粗提液，再经过柱平衡、上样、洗涤、洗脱、柱再生、沉淀、离心、脱水和真空干燥等步骤初步分离纯化，得到一种海带抗氧化肽产品。

2.根据权利要求1所述的制备海带抗氧化肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）溶解离心：取海带干粉，先用PBS缓冲液将海带干粉溶解，搅拌2-8h，10000r/min离心5-60min，取上清液；将沉淀溶于2-10倍（w/v）蒸馏水后继续搅拌2-8h后再次10000r/min离心5-60min，取上清液；再将沉淀溶解于2-10倍（w/v）蒸馏水进行第三次搅拌，离心后取上清液，作为上柱液;

（2）柱平衡：用平衡缓冲液平衡柱体，用恒流泵控制流速为100-700ml/min，平衡时间1-5小时;

（3）上样：将上柱液加入层析柱，恒流泵控制流速为100-700ml/min；上样结束后，用平衡缓冲液洗涤层析柱，恒流泵控制流速为200-800ml/min;

洗涤：用洗涤缓冲液洗涤层析柱，恒流泵控制流速为200-800ml/min;

（5）洗脱：洗涤结束后，用洗脱液洗脱层析柱，恒流泵控制流速为300-900ml/min；洗脱的同时，使用核酸蛋白检测仪粗略测量流出液100-640nmOD值，当OD值接近0.05-0.95时改用紫外分光光度计精密测量OD值，当流出液OD值在0.2-0.7以上，开始收集流出液，直到OD值在0.2-0.7以下，停止收集流出液;

（6）柱再生：洗脱结束后，用氢氧化钠溶液的再生液洗涤层析柱，之后再用纯化水洗涤层析柱，流速均用恒流泵控制在100-1000ml/min;

（7）沉淀：计量收集流出液体积，转入不锈钢桶内，边搅边加入流出液体积2-8倍量(v/v)的冷乙醇，乙醇温度不超过-5℃，静置沉淀12-36小时，至乙醇澄清沉淀物全部沉于不锈钢桶底部;

（8）离心、脱水：用软管自然虹吸上层乙醇，下层沉淀物装入离心杯用低速大容量冷冻离心机离心，使固液分离，设定离心转速不低于2500-5000rpm；离心结束后，弃去上层母液，收集下层固体，按固体物重量1:2-1:9（w/v）比例于离心杯内加入无水乙醇脱水1-4次，再按上述步骤离心，收集固体物干燥;

（9）真空干燥：将上述盛有离心固体物的离心杯放置于真空干燥箱，干燥10-35小时以上，干燥后即得产品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，按干粉重量1:5-1:90（w/v）的比例量取PBS缓冲液，PBS缓冲液pH7.2～7.4，其中NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L， KH₂PO₄ 2mmol/L。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，平衡缓冲液为0.05mol/L乙酸钠溶液（pH 3.0-7.5）。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，洗涤缓冲液为取0.1mol/L乙酸钠溶液（pH 2.0-9.0）。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，洗脱液为1.0mol/L氯化钠溶液（pH2.5-10.0）。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（6）中，再生液为0.1-1.0mol /L氢氧化钠溶液。