[发明专利]一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法

说明书

本发明提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，包括以下步骤：将油佐剂疫苗破乳，将破乳后的抗原样品进行定量分析，同时采用凝胶电泳的手段进行纯化，然后将纯化后的抗原样品进行定性检测；所述破乳方法为：将油佐剂疫苗与破乳剂混合，分层后得水相抗原样品；所述破乳剂包括有机溶剂与酸的混合物，所述有机溶剂选自乙腈、正丁醇、苯甲醇、丁基二乙二醇、乙醇中的一种，所述酸选自盐酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸中的一种。本发明提供的破乳方法破乳能力更强，能保证抗原主要分布于水相中，且水相与油相能完全分离，能真实反应出疫苗内有效抗原的含量及质量；通过将破乳后的抗原采用电泳进行分离纯化，提高了抗原的纯度。

技术领域

本发明涉及口蹄疫疫苗检测技术领域，具体涉及一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法。

背景技术

现有的疫苗质量标准中规定效力检验必须采用本动物进行检验，由于国家实行100％的强化免疫政策，很难选出易感的检验用动物，而且动物攻毒对实验设施要求高(BSL3级实验室)、耗时长(一个月以上)、资金花费大。如果采用血清中和试验选择易感动物，在技术上难以排除具有细胞免疫的非易感动物，在检验实际中经常发生检验数据不规律的问题，影响检验的准确性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的质量检测一直困扰着兽药监测部门和相关生产企业。因此需要尽快研制体外检验技术，代替现有的本动物试验。

当前国家对疫苗的检验正逐步过渡到对疫苗内抗原的检测，而当前较为普遍的方法为疫苗破乳后对抗原进行检测，通过将疫苗进行破乳处理，使抗原转移至水相中，继而对其进行后续的检测分析。众所周知，疫苗是由抗原与佐剂以一定比例、按特定程序乳化而成的，然而佐剂却为疫苗破乳检测带来了巨大障碍。

现有技术中主流的样品纯化手段为各类层析，而层析过程所需要的样品量大，不仅会造成约30％～50％的样品损失(在起始样品量低时更易引起扩散作用)，同时对设备依赖性较高。油佐剂疫苗中的抗原浓度为微克级，经过破乳过程后会造成一部分抗原的损失，再使用层析的方式进行纯化，其抗原回收率极低，无法用于检测，若加大疫苗破乳量，则会造成疫苗浪费，且油佐剂中杂质会加速缩短层析填料使用寿命，其经济性不佳。

现有的凝胶电泳纯化技术中，所分离的复杂样品其成分均为生物分子及其同类物，而非其他复杂性质的物质，其中处理的样品成分相比于破乳后水相其样品状态更为简单。现有的蛋白质电泳后胶内酶解技术，其程序较多，步骤复杂，经过操作后其回收率低，微量样品经过处理后所能回收的样品已无法满足检测要求。

目前国内各大厂家都在探索一种实用的方法，能够对经破乳处理的疫苗中抗原进行处理，减少抗原中的杂质对其后续定性定量检测分析的影响。破乳后水相中存在的表面活性剂等物质在业内被公认为最难处理的杂质，业内现有技术并不能对破乳后水相直接进行检测。本发明中针对的样品成分复杂，且疫苗中蛋白浓度低并不适合传统纯化方法，破乳后水相中又含有的表面活性剂等杂质，不仅以游离状态存在，其双亲的性质还会与蛋白相结合，在电场力的作用下会使得杂质与蛋白的结合键打开，在凝胶中实现分离纯化。通过凝胶电泳的方式纯化相比传统方式其所需的样品量将大大减少，并大幅降低对操作人员及仪器设备的依赖性，同时可使与蛋白黏连的杂质与蛋白分离。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，包括以下步骤：将油佐剂疫苗破乳，将破乳后的抗原样品进行定量分析，同时采用凝胶电泳的手段进行纯化，然后将纯化后的抗原样品进行定性检测；

所述破乳方法为：将口蹄疫合成疫苗与破乳剂混合，分层后得水相抗原样品；所述破乳剂包括有机溶剂与酸的混合物，所述有机溶剂选自乙腈、正丁醇、苯甲醇、丁基二乙二醇、乙醇中的一种，所述酸选自盐酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸中的一种。取水相经液相色谱检测，抗原回收率可达90％以上。