[发明专利]一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法

权利要求书

1.一种谷子SIARGOS基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

通过拟南芥ARGOS的mRNA序列，在phtozome网站blast，得到谷子中的ARGOS序列，编号Si027037m，根据此序列，采用软件Primer Premier5.0设计包含该基因ORF的引物Siargos，引物序列为：Siargos-1F：ACAAATCCCCACCCTTGTCA，Siargos-1R：ACTCCTGAAAAGATGCTTCACA，以晋29A和K186的cDNA为模板，扩增得到PCR产物，经克隆测序后得到目标序列；PCR扩增总体积20μL包括：模板2μL，2×GC Buffer10μL，10mmol/L dNTPs0.4μL，2μmol/L特异引物4μL，rTaq DNA聚合酶0.2μL，双蒸水4μL；PCR扩增程序：首先，95℃预变性3min；然后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测；

根据phtozome网站序号Si027037m，将该基因向上游延伸2kb，用软件Primer Premier5.0设计启动子区PCR引物Argos-Pro，引物序列为：Argos-Pro-F：CTCTGTCGTCTGCAAGCAA和Argos-Pro-R：ACTGACAAGGGTGGGGATTT，以晋29A和K186基因组DNA为模板，扩增体系和条件：除退火温度和延伸时间改为60℃退火30s，72℃延伸2min，扩增得到PCR产物，经克隆测序获得该基因启动子区序列：将获得启动子序列提交到PlantCARE，进行顺式作用元件的预测。

2.一种SiARGOS基因的表达分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

蛋白比对采用DNAMAN软件，同源进化分析采用MEGA5生成无根进化树，进化树生成采用邻接法；

分别取晋29A、K186和“晋29AxK186”杂种F₁3d-9d的根系置于液氮中，提取RNA反转录后，采用Bio-Rad C1000cycler real time PCR system进行实时荧光定量PCR分析；实时定量引物为SiArgos-RT-F：TTGCGTCGACTTACTTCAGC，SiArgos-RT-R：CATGCTCCTCACATCGGTTG；以谷子ACTIN基因作为对照(SiActin-F：TTCCCTGGTATTGCTGACCG，SiActin-R：CTCACCCTTCGAGATCCACA)；反应总体积10μL，包括：1/10cDNA template1μL，SYBR Premix Ex Taq5μL，2μmol/L特异引物1μL，ddH₂O3μL；RT-PCR扩增程序：首先，94℃预变性5min；然后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min；65℃-98℃绘制溶解曲线；采用比较阈值法进行定量分析，手工设定荧光阈值，确定循环数Ct值，根据Ct值，计算个样本的C值，C＝2^-ΔCt，^ΔCt＝Ct_目标基因-Ct_内标基因；实验设置3次生物学重复并采用双尾等方差t检验的方法进行显著性检验。

3.一种SiARGOS基因功能标记的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：

对19份谷子材料进行基因编码区及启动子全长测序，用引物Siargos和Argos-Pro分别进行SiARGOS基因编码区和启动子扩增，用PCR产物进行克隆测序，利用DNAstar软件系统的Sequman、Editseq和MegAlign软件包进行DNA序列的分析，包括拼接、整理与SNP和单倍型分析；引物Siargos的扩增产物经限制性内切酶Acc II酶切后的片段差异，用于检测151bp位点的碱基差异；根据启动子区2处插入和缺失设计SSR引物AP-1和AP-2，用于启动子区的单倍型分型，其中AP-1-F：AGATGACTCTAAAGGGCATCG，AP-1-R：CAAGGGCAGCAGTGTTTTC；AP-2-F：GTCTTTTGGGATTGTGTCATC，AP-2-R：TGACTAATGTGGTACGGGTC。