[发明专利]鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法及应用

说明书

本发明公开了鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法及应用，利用紫黑色条纹果皮番茄所携带的分子标记序列为SEQ ID No.1的核苷酸碱基序列，以紫黑色条纹果皮番茄基因组DNA模板经PCR扩增，SEQ ID No.3‑4的核苷酸碱基序列为扩增引物，进行扩增并酶切，经酶切后可获得区别于其他番茄果皮颜色的特异谱带，该分子标记方法应用于番茄品种改良以及育种；与现有技术相比，本发明采用的CAPS分子标记方法，通过PCR扩增、酶切、凝胶电泳分离酶切片段，观察其多态性，避免了传统RFLP分析中的转膜步骤，简化了操作，同时保持RFLP技术的精确度，检测到多态性机会较大，快速获得紫黑色条纹果皮番茄并应用于品种改良、辅助育种，对于培育富含花青素的番茄新品种具有重要的理论和实践意义。

技术领域

本发明属于生物检测领域，尤其是鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法及应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)属于茄科茄属，是世界第一大蔬菜作物，起源于南美安第斯山脉，在16世纪左右被西班牙殖民者引入欧洲，经过几次强烈驯化和改良后成为现代栽培番茄。相较于其他性状，番茄果肉的颜色的驯化历程相对较短，几乎都是最近100年涌现出来的。现有栽培番茄的成熟果实颜色主要为红色、黄色和粉色，这是由于果实中富含番茄红素和类胡萝卜素等色素的原因。尽管番茄红素和类胡萝卜素都是对人体非常有益的天然色素，但这两类色素都属于脂溶性物质，必须通过正确的烹调或加工才能被人体良好吸收，对于食品结构单一的贫困人群发挥作用比较困难。因此，开发含有其他天然营养色素的番茄品种，是番茄育种工作的重要发展方向。

此前已经发现，某些野生种番茄，如S.chilense和S.cheesmaniae等，具有深蓝色的果实，富含花青素。研究表明，花青素作为强抗氧化剂，具有抗衰老、调节免疫力、抵抗突变等功效，且属于水溶性物质，鲜食即可吸收。因此，这些野生种番茄是开发新型番茄品种的重要种质资源。目前，美国俄勒冈州立大学利用野生蓝色番茄资源，育成紫色番茄OSUBlue等品种，以色列研究者也利用分子生物学技术，在番茄染色体上定位了一个控制花青素含量的显性基因座用于OSU Blue等品种的育种。2013年，江苏省农业科学院蔬菜研究所在国内首次自主育成紫黑色条纹果皮番茄，并命名为“金陵墨玉”，其成熟果皮性状与国外OSU Blue等品种存在显著差别，呈紫黑色条纹状。“金陵墨玉”花青素含量是普通栽培番茄的10倍以上，平均单果重30克，果实大小均匀，口感风味浓郁，高抗病毒病，耐叶霉病，具有很高的营养和经济价值。经过遗传分析，“金陵墨玉”的紫黑色果皮性状为隐性性状，并非由已知的Aft显性基因控制。因此，迫切需要开发与“金陵墨玉”紫黑色果皮性状连锁的新型分子标记，用于指导育种。

酶切扩增多态性序列，简称CAPS，是一种共显性分子标记，原理是根据己知位点的DNA序列设计特异性PCR引物，利用这些引物扩增该位点上的某一特定DNA片段，然后用某种限制性内切酶切割扩增产物，通过凝胶电泳分离酶切片段，观察其多态性。CAPS技术实质上是将PCR技术与限制性片段长度多态性，即RFLP技术相结合，因此又被称为PCR-RFLP。本发明采用CAPS标记方法进行“金陵墨玉”特异性状的标记及鉴别，通过人工设计的PCR引物，进而快速筛选、培育紫黑色条纹果皮番茄——“金陵墨玉”，对培育富含花青素番茄新品种具有重要的理论及实践意义。

发明内容

为了快速鉴别、育种富含花青素的番茄——金陵墨玉，提供更高营养价值的新品种，本发明公开了鉴别番茄紫黑色果皮性状连锁的CAPS标记方法及应用，可应用于番茄品种改良分子辅助育种，在苗期即可进行初期筛选，大大缩短育种周期，其技术方案如下：