[发明专利]鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法及应用

权利要求书

1.鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法，其特征在于：所述紫黑色条纹果皮番茄所携带的分子标记序列位于3号染色体上，为SEQ ID No.1的核苷酸碱基序列，所述紫黑色条纹果皮番茄基因组DNA模板经PCR扩增，其中紫黑色条纹果皮番茄的扩增引物为SEQID No.3-4的核苷酸碱基序列，所述SEQ ID No.3-4的核苷酸碱基序列为人工设计，扩增产物经限制性内酶酶切，所述限制性内切酶为Lightning^TM NheI限制性内切酶，经酶切后可获得区别于其他番茄果皮颜色的特异谱带，所述紫黑色条纹果皮番茄特异性谱带为一条613bp，所述CAPS标记方法包括如下步骤：

(1)以紫黑色条纹果皮番茄为母本，绿色番茄为父本进行杂交，其中所述绿色番茄携带的分子标记序列为SEQ ID No.2的核苷酸碱基序列，两者杂交获得F1代，所述F1代果实发育到红熟期时果皮性状全为绿色；

(2)将上述步骤(1)中获得的F1代进行自交，获得F2代，所述F2代果实发育到红熟期时果皮性状出现性状分离；

(3)采集亲本、F1代、F2代中成熟的果皮颜色不同的番茄植株叶片，使用CTAB法提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以人工合成的碱基序列SEQ ID No.3-4为引物，进行PCR扩增；

(4)提取将上述步骤(3)中的PCR扩增产物10μl，在1％琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果；确认无误后，使用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，保存于4℃备用；

(5)将上述步骤(4)中获得的不同个体基因组DNA的PCR扩增产物，分别使用Lightning^TMNheI快速限制性内切酶进行酶切；

(6)将上述步骤(5)酶切后的产物在1％琼脂糖凝胶上检测酶切结果，所述凝胶电泳反应条件为85V/100mA电泳20分钟；

其中，纯合的紫黑色条纹果皮番茄DNA扩增产物无法被Lightning^TM NheI酶切，表现为1条长度为613bp的条带，纯合的绿色番茄的DNA扩增产物完全被Lightning^TM NheI酶切，表现为2条长度分别为390bp和223bp的条带；杂合的F1代仅有1条染色体DNA的扩增产物可以被Lightning^TM NheI酶切，表现为3条长度分别为613bp、390bp和223bp的条带；

所述紫黑色条纹果皮番茄F2代为隐性纯合基因型，无法被Lightning^TM NheI酶切，表现为1条长度为613bp的条带，绿色番茄的F2代为显性纯合或杂合，可以完全或部分被Lightning^TM NheI酶切，表现为2条长度分别为390bp和223bp的条带，或3条长度分别为613bp、390bp和223bp的条带，橙色果皮等其他颜色过渡性状F2代也可能为杂合或隐性纯合，可以部分或完全被Lightning^TM NheI酶切，表现为3条长度分别为613bp、390bp和223bp的条带，或2条长度分别为390bp和223bp的条带。

2.根据权利要求1所述的鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法，其特征在于：所述PCR扩增体系总体积为50 μl，其中：模板DNA 5 μl，5 U/μl Taq-Plus DNA聚合酶0.5 μl，含Mg²⁺ 的10× PCR Buffer for Taq5 μl，dNTPs mixture 4 μl，10 μM的正向引物和反向引物各1 μl，ddH₂O 33.5 μl；所述PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃再延伸5分钟。

3.根据权利要求1所述的鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法，其特征在于：所述酶切反应体系为：底物DNA 10 μl，10× CutOne^TM Buffer 3 μl，Lightning^TM NheI 1μl，ddH₂O 16 μl；酶切条件为37℃孵育15分钟，随即80℃孵育20分钟使限制酶失活，停止反应。

4.如权利要求1所述的鉴别紫黑色条纹果皮番茄的CAPS分子标记方法的应用，其特征在于：所述分子标记方法在番茄品种改良以及育种中的应用。