[发明专利]一种Ⅲ型前胶原N端肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断免疫检测领域，具体地，本发明提供了一种化学发光免疫检测Ⅲ型前胶原N端肽试剂盒及其制备方法。

背景技术

肝硬化是一类严重威胁人类生命和健康的疾病，而肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段。因此，及早发现和治疗肝纤维化对防治疾病恶化具有重要作用。Ⅲ型前胶原N端肽是目前临床上用于诊断肝纤维化的重要血清标志物，对于早期诊断肝纤维化及预后评估均有重要的临床意义。

目前临床检测Ⅲ型前胶原N端肽的常见方法有酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、酶促化学发光法，但这些方法都存在着一些不足之处。

一、酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法(ELISA) 被广泛应用，但该方法也存在着下述的不足之处：

(1) 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96 孔专用微孔板作为抗原包被用具和反应容器，在使用时只能分成12 批次、6 批次、8 批次或整板一次使用，无法进行独立的、单人份的检测；

(2) 定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加注试剂的操作也极为繁琐；

(3) 缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大的随意性；

(4) 检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果的准确性；

(5) 检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差；

(6) 在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数×48/96人份，如果需要检测10 个项目，则试剂的配置及使用数须为10×48/96人份，如果只有一份样本需要检测10 个不同的项目，也需要配置10×48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。

二、放射免疫分析法

放射免疫分析方法放射性污染大、加样步骤繁琐、操作复杂、操作时间长、测定结果不稳定、试剂保存时间短、试剂盒操作自动化程度低、配套仪器价格昂贵等不足之处。

三、化学发光法

化学发光法按发光原理可分为直接化学发光和酶促化学发光。

酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶两种，但都有一定的局限性，辣根过氧化物酶主要缺点为：鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H2O2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。碱性磷酸酶主要缺点为：底物达到平台期的时间长，底物成本高，导致检测成本高，患者负担重。

吖啶酯作为标记物的直接化学发光相比酶促化学发光具有明细优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，可以两点定标，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。

发明内容

目前Ⅲ型前胶原N端肽检测技术存在以下缺点：检测成本高、检测灵敏度低、检测线性范围窄、重现性低、不能定量、操作复杂等。

本发明正是为了克服以上所述缺点，公开了一种检测成本低、灵敏度高、检测线性范围广、重现性高、可以定量、操作简单的Ⅲ型前胶原N端肽试剂盒及其制备方法。本发明首先制备化学发光免疫分析试剂盒，主要包括：Ⅲ型前胶原N端肽单克隆抗体包被的磁颗粒、Ⅲ型前胶原N端肽单克隆抗体包被的吖啶酯以及Ⅲ型前胶原N端肽定标品；然后利用全自动化学发光免疫分析仪对定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件，测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度；最后对Ⅲ型前胶原N端肽全自动化学发光免疫分析系统进行性能（灵敏度、线性、精密度、干扰性）的评价。

本发明与目前技术相比，具有以下优点：

1、本发明选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；

2、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统检测灵敏度高，能够达到0.2 ng/mL，相比其它的Ⅲ型前胶原N端肽检测方法灵敏度至少提高了10倍；