[发明专利]一种KAP13-1基因在绵羊毛纤维细度鉴定中的应用

说明书

本发明涉及一种KAP13‐1基因在绵羊毛纤维细度鉴定中的应用。根据牛KAP13‐1基因设计引物，以绵羊皮肤cDNA为模板，RT‐PCR绵羊KAP13‐1基因片段；根据绵羊KAP13‐1基因的氨基酸序列制备多克隆抗体，用免疫组化检测KAP13‐1基因在绵羊毛囊中表达量；(3)利用2A肽序列构建绵羊启动子驱动的共表达绵羊KAP13‐1和绿荧光蛋白的重组载体；以KAP13‐1基因和ZsGreen1‐1载体中绿荧光蛋白基因设计引物；融合PCR得到KAP13‐1‐2A‐ZSG，用连接酶将KAP13‐1‐2A‐ZSG连接到双酶切载体中；以绵羊脾脏基因组为模板扩增KAP11‐1基因启动子，酶切连接到中间载体中获重组载体(4)用重组载体转化昆明小鼠，鉴定转基因阳性小鼠毛纤维皮质部中的表达量，并检测距离毛囊底部130μm处毛纤维的直径。

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种KAP13-1基因在绵羊毛纤维细度鉴定中的应用。

背景技术

毛囊是一个复杂的微器官，其由外到内包括外根鞘、伴随层、内根鞘(亨利层、赫胥黎层、鞘小皮)、毛干(角质层、皮质层、髓质层)。此外，毛囊具有毛囊干细胞富集的膨大部、含有大量快速增殖细胞的毛母质和在信号交流中起重要作用的毛乳头。研究毛囊不同结构或细胞的功能有助于全面地了解毛囊生长发育过程进而提高毛纤维品质。毛纤维作为毛囊的最终产物，不仅对动物自身具有重要的保护作用而且具有很大的经济价值。毛纤维主要由外侧的鳞片层、中间的皮质层和内部的髓质层组成。皮质层由角蛋白和角蛋白关联蛋白组装成的纤维束构成，是毛纤维的重要组成部分。皮质层中的蛋白通过盐键、氢键及二硫键相互作用使毛纤维富有弹性、张力和韧性；皮质层含有色素细胞，决定毛纤维颜色的深浅；而且皮质层控制毛纤维的水分和曲直。因此，毛纤维的皮质部对毛纤维的物理特性具有重要作用。研究皮质部蛋白的功能可以揭示毛纤维的形成过程和各蛋白对毛纤维理化性质的影响。

毛纤维中的角蛋白关联蛋白(Kertain associated protein)是在皮质部中围绕角蛋白(Kertain)的不规则基质的重要组成部分(Rogers and Schweizer,2005)。许多研究者认为角蛋白关联蛋白在毛纤维形成过程中具有重要作用(Shimomura and Ito,2005；Fujikawa et al.,2012)。在毛纤维形成过程中，角蛋白关联蛋白好像“胶水”一样将各角蛋白结合起来(Rogers and Schweizer,2005)。根据氨基酸组成，角蛋白关联蛋白可以分为高硫、超高硫和高甘氨酸/酪氨酸角蛋白关联蛋白(Shimomura and Ito,2005)。高硫和超高硫角蛋白关联蛋白主要通过与角蛋白形成二硫键在毛纤维的形成中发挥作用；而高甘氨酸/酪氨酸角蛋白关联蛋白不仅可以与角蛋白相互作用而且还可以与细胞桥粒作用促进毛纤维的形成(Matsunaga et al.,2013)。角蛋白关联蛋白在哺乳动物中特异表达，并且具有许多特点。首先，不同种类的角蛋白关联蛋白与不同的毛纤维的特性有密切联系；其次，由于角蛋白关联蛋白半胱氨酸富集区段的重复导致长度的多态性，而半胱氨酸的含量差异导致了相应角蛋白关联蛋白对毛纤维形成作用的差异；不同角蛋白关联蛋白基因的多样性也影响了其表达量的不同(Wu et al.,2008；Khan et al.,2014)。因此，角蛋白关联蛋白的多样性很可能导致了哺乳动物毛纤维形态的多样性。

KAP13-1属于高硫角蛋白关联蛋白。公开号：CN103642806B的专利文献报道了绵羊KAP13-1在毛囊中高表达。在羊毛纤维的蛋白质组学研究中，KAP13-1的表达起始于羊毛纤维角质化部位(Plowman et al.,2015)。此外，在不同品种的绵羊群体中，KAP13-1在不同位点呈现出多态性，进一步的关联分析表明KAP13-1中的多态位点与产毛量、柔韧性及产绒性状存在紧密关联。上述结果表明KAP13-1对毛纤维的形成具有重要作用，但是其具体功能尚不清楚。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提高一种KAP13-1基因在绵羊毛纤维细度鉴定中的应用，检测绵羊KAP13-1对毛纤维细度的影响，利用该基因作为在绵羊毛纤维细度鉴定中的应用。