[发明专利]一种脂肪酶的固定化方法

说明书

本发明公开了一种脂肪酶的固定化方法，所述方法为：将脂肪酶、蛋白连接肽和壳聚糖结合域氨基酸序列依次连接成脂肪酶融合蛋白，以壳聚糖为载体，将脂肪酶融合蛋白进行固定化，得到固定化脂肪酶；本发明固定化脂肪酶经过十五次的回收利用固定化脂肪酶融合蛋白催化的棕榈酸十六酯的转化率仍能保持在90％；本发明方法可以规模化生产，可以提高脂肪酶生产量，降低生产成本。

(一)技术领域

本发明涉及一种脂肪酶的固定化方法。

(二)背景技术

脂肪酶，全称为三酰基甘油水解酶，是一类特殊的酰基水解酶，它能够在脂-水界面上催化酯键水解、酯合成、酯交换和立体异构体拆分等化学反应。脂肪酶在食品加工、饲料工业、化学催化、油脂加工、造纸工业、洗涤工业、皮革加工、纺织工业和生物柴油生产中被大量应用。随着脂肪酶生产成本降低、生产规模扩大、脂肪酶应用工艺的提升，工业生产中对脂肪酶的需求正在不断扩大。

在工业应用中，直接使用游离脂肪酶，反应完成后很难将脂肪酶分离，一方面影响后续的连续化生产，一方面也造成酶浪费。将脂肪酶固定在载体上，制备成固定化脂肪酶，既能保持脂肪酶的催化活性，又容易将酶与反应产物分离，还能实现脂肪酶的回收利用。固定化脂肪酶能够极大提升脂肪酶在工业生产中的应用范围，降低应用成本。目前，酶的固定主要有吸附、交联、包埋和共价结合等方法。吸附法是通过离子作用或物理吸附将酶固定在载体上，操作简单，条件温和，对酶活性影响较小，但是物理吸附作用力较弱，固定的酶容易流失。交联法则是通过双功能或多功能试剂使酶分子之间交联实现固定化，固定的酶很牢固，但是交联条件苛刻，对酶活性影响比较大。包埋和共价等固定方法也各有利弊，不同的固定方法适应于不同反应和应用，因此发展多样化的固定方法对扩大脂肪酶使用范围，降低使用成本具有重要的价值。目前工业用脂肪酶主要依靠微生物发酵获得，微生物发酵法对生产设备、运输储存要求高，生产规模扩张难度大，产能有限，生产成本高，而且生产工艺复杂，酶纯化难度也大，提高产能，降低生产成本是脂肪酶工业生产中需要解决的重要问题。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种能够高效固定在壳聚糖上的固定化脂肪酶，及其规模化生产方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种脂肪酶的固定化方法，所述方法为：将脂肪酶、蛋白连接肽和壳聚糖结合域氨基酸序列依次连接成脂肪酶融合蛋白，以壳聚糖为载体，将脂肪酶融合蛋白进行固定化，得到固定化脂肪酶；所述蛋白连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，所述壳聚糖结合域氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

进一步，所述脂肪酶氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述脂肪酶融合蛋白固定化方法为：通过农杆菌侵染法将脂肪酶融合蛋白转化水稻，获得含有脂肪酶融合蛋白基因的转基因水稻种子，将水稻种子提纯，获得脂肪酶融合蛋白溶液；将壳聚糖加入体积浓度1％的乙酸水溶液中，充分溶解，形成胶状液；将胶状液滴加到1mol/L的NaOH水溶液中，形成球形颗粒，水洗至中性，干燥后作为固体载体；然后将固体载体加入脂肪酶融合蛋白溶液中，28℃静置2h，用去离子水淋洗干净，室温干燥，得到固定化脂肪酶。

进一步，所述脂肪酶融合蛋白转化水稻是构建含有由水稻胚乳特异性启动子介导的脂肪酶融合蛋白表达框和植物转化筛选标记的水稻遗传转化载体。所述水稻胚乳特异性启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。更具体是将脂肪酶融合蛋白编码基因和35S终止子连接(核苷酸序列为SEQ ID NO.4)，再与水稻种子特异性表达启动子一起连入pCAMB1300(GenBank:AF234296.1)载体的T-DNA中，获得水稻转化载体pCAMB1300-GT1-CalB-CBM，利用电击转化法将转化载体pCAMB1300-GT1-CalB-CBM导入农杆菌(LBA4404)细胞中，获得含有转化载体的农杆菌转化株系。