[发明专利]一种脂化Ag85A蛋白

说明书

本发明提供了一种脂化Ag85A蛋白的制作方法，将Ag85A抗原基因与P4脂蛋白序列重组成脂化基团，组合到复制缺陷型腺病毒载体(Ad5)中，通过外源表达得到重组Ad5‑LAg85A，此重组腺病毒可在体外HEK293细胞系中自动表达LAg85A蛋白。通过该方法可以获得如序列表所示序列的重组腺病毒疫苗，该疫苗在预防结核杆菌感染疾病方面具有应用价值。

技术领域

本发明涉及疫苗制备技术领域，具体的说是一种脂化Ag85A蛋白及其腺病毒载体疫苗制备方法与应用。

背景技术

结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的严重危害人类健康的呼吸道传染病，每年约有超过900万人新感染结核分支杆菌，其中约有150万人死亡^[1]。

传统的结核病疫苗——卡介苗(Bacillus Calmettee-Guerin，BCG)已经使用多年，该疫苗于1974年被WHO批准列入扩大免疫规划。在过去的几十年中，卡介苗已经成为使用最广泛的疫苗，但由于无法产生持久的记忆效应，其免疫效果多在免疫后10-15年完全丧失，对成人肺结核基本没有保护效果^[2,3]。并且，该疫苗的保护率明显受暴露于环境中的结核杆菌影响，在南非，BCG保护率为0％，而在英国则约为80％^[2]。限于卡介苗有限的保护性，以及耐药结核分枝杆菌的传播，我们需要寻找能够诱导长期免疫保护的新型结核病疫苗。

Ag85A蛋白是结核杆菌分泌的一种主要抗原，具有分枝菌酸转移酶活性，对细胞壁的合成有重要作用。Ag85A也参与脂质的积累和储存，可能对结核分枝杆菌的休眠有重大意义。Ag85A蛋白广泛存在于分枝杆菌中，包括结核分枝杆菌、卡介苗和环境分枝杆菌，能诱导较强的Th1型细胞免疫应答。在经卡介苗免疫或在环境中接触结核杆菌的情况下，病毒载体能克服Ag85A预存免疫，并诱导高水平的Ag85A抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞反应，获得较好的免疫效果^[4]。目前已有四种以病毒载体表达Ag85A的疫苗进入临床研究，具体参见表1.

表1以Ag85A为目的蛋白的病毒载体疫苗(已进入临床)

以Ad5作为疫苗载体可以有效激发细胞免疫和体液免疫，但唯一的缺点是人体普遍存在滴度很高的抗Ad5型抗体，目前有效克服预存免疫对Ad5型腺病毒载体疫苗影响的方法有两个，其一是增加免疫的剂量，其二是粘膜免疫；由于结核分枝杆菌主要感染器官为肺部，因此，粘膜免疫对清除肺部的细菌更有优势。

选择结核分枝杆菌的潜在抗原进行可预防成人感染结核杆菌的候选疫苗研究有大量的文献报告，但是所有的抗原基本是基于肌肉注射这个途径进行的；粘膜免疫制剂开发的最大的难点是需要克服粘膜层对抗原的有效吸附，当然，如果是肠道系统摄入抗原的话，则还需要防止胃酸等对抗原的降解。为此，开发易于呼吸道粘膜有效摄入抗原，而不被降解的粘膜制剂是该来产品最核心的技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于设计易于呼吸道粘膜有效摄入抗原的制剂技术

本发明所要解决的另一技术问题在于利用所述增强呼吸道粘膜有效摄入抗原的技术增强Ag85A抗原粘膜免疫原性的方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于利用所述增强Ag85A抗原粘膜免疫原性的方法获得可以表达脂化Ag85A蛋白的腺病毒载体疫苗。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述表达脂化Ag85A蛋白的腺病毒载体疫苗的制备方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述表达脂化Ag85A蛋白的腺病毒载体疫苗的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：