[发明专利]一种高效稳定表达抗体的杀伤性细胞及其用途

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种高效稳定表达抗体的杀伤性细胞及其用途。

背景技术

癌症现在已成为人类健康的头号杀手，快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症发生的帮凶，使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显。目前传统治疗手段疗效已到瓶颈，亟需探索一个更加有效的治疗方法，来提高癌症患者的生存率和生存质量。针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得令人瞩目的临床疗效。2011年，Nature及临床肿瘤最顶级杂志JCO分别发表相同题目“肿瘤免疫治疗的时代已经来临”的评论文章(Nature.2011；480(7378):480；J Clin Oncol.2011；29(36):4828)，肿瘤免疫细胞治疗迎来新一轮的研究高潮，未来有可能在肿瘤治疗中占据相当重要的地位。

“免疫作用”可分为细胞免疫及体液免疫，两者具有截然不同杀灭肿瘤或病毒的方式。细胞免疫是以细胞直接发挥效应来清除异物，它是机体免疫应答的参与者，也是免疫功能的执行者。目前用于临床治疗的效应免疫细胞，即杀伤性免疫细胞，主要包括自然杀伤细胞(nature killer，NK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell，LAK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine activated killer cells，CIK)、树突状细胞刺激的细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)、CD3AK细胞(抗CD3单抗的杀伤细胞)等，这些细胞都不表达抗体，它们直接杀灭或通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性细胞效应(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)起作用。

体液免疫是由抗体所介导产生作用，人体内的抗体是由B淋巴细胞产生。1997年，第一个用于临床癌症治疗的单抗——抗人CD20(rituximab)获得FDA批准。随着抗体技术的发展，至今全球已报道的抗体有10多万种，其中基因工程抗体有1000多种，人源化抗体200多种。截止2016年3月，FDA至今已批准50个抗体上市，其中26个用于肿瘤治疗，这些抗体既有作用于肿瘤细胞本身直接发挥作用，也有作用于免疫细胞间接发挥作用。

然而，效应免疫细胞虽然具有一定的抗肿瘤作用，但其临床治疗效果有限；而大分子抗体对实体瘤的穿透力不足，且全身用药有可能引起系统性不良反应。例如，HER2单抗具有心脏毒性，而PD1抗体打破机体免疫平衡，可引起自身免疫疾病。而且，由于抗体药物涉及复杂的体外生产与制备工艺，纯度要求高且用量大，导致用药费用高昂。因而，如果在细胞免疫效应细胞保持细胞杀伤毒性的前提下，能由其高效表达具有抗肿瘤活性的抗体，将同时克服细胞免疫治疗作用不足与大分子抗体难以进入实体瘤内部的困难，同时可以降低治疗成本。这些既具有细胞杀伤毒性、又能高水平表达抗体的细胞，在趋化因子作用下，经过细胞变形主动进入肿瘤组织内部，从而在肿瘤组织局部高水平表达抗体，可以避免全身性用药带来的副作用。同时，作用于免疫细胞自身的抗体(如HER2抗体Herceptin)，由于抗体与细胞杀伤毒性免疫细胞双重存在，可产生强烈的ADCC效应及CDC效应，高效杀灭肿瘤细胞；而作用于T细胞自身的抗体(如PD1抗体Keytruda)，可以避免肿瘤微环境对回输的效应性T细胞的抑制作用，使其持续发挥治疗作用。

尽管已经有将外源基因转导入例如NK细胞或T细胞的报导，但目前常用基因转染载体系统对具有细胞杀伤毒性的效应免疫细胞转染率低，或者难以使外源基因在其细胞内高水平地表达。利用腺病毒载体(非整合型)可以介导外源基因在NK细胞或T细胞内较高效的短时表达，但活化的NK细胞或T细胞增殖速度非常快，携带的外源基因表达框在细胞传代中将快速丢失，表达难以持久；利用逆转录病毒或慢病毒可以介导外源基因在NK细胞或T细胞基因组中的整合，理论上可实现稳定表达，但抗体包含轻链与重链，编码序列长、分子量大，导致携带全长抗体表达框的逆转录病毒或慢病毒的包装与制备存在较大困难、难以高效表达抗体，只能用于表达结构简单的单链抗体(缺乏Fc段片段，功能不全且半衰期短)。因而在此之前，尚无具有细胞杀伤毒性并且能稳定、高水平地表达含有人Fc段的抗体的转基因细胞的报道。

发明内容