[发明专利]一种纯化抗体的方法及所用缓冲液

说明书

一种纯化抗体的方法及所用缓冲液，属于生物医药领域，用于降低抗体分子在低pH处理过程中形成聚集物，技术方案包括在低pH缓冲液中添加一定浓度的甘露醇，该方法能够将IgG4亚型抗体（包括含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白）在低pH下形成的聚集物的比例从30%降低到2%，从而提高抗体的纯化得率以及抗体药的活性和安全性。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种纯化抗体的方法及所用缓冲液。

背景技术

抗体药是近年来增长迅速的药物种类，新药品种和市场份额不断增加，在恶性肿瘤和自身免疫疾病等疾病的治疗上发挥着越来越大的作用。抗体药出现早期IgG1亚型的抗体占据主导地位，几乎所有的早期抗体药都是IgG1亚型。近几年IgG4亚型的抗体药开始走向市场。IgG4亚型抗体有较弱的ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞毒性）和CDC（补体依赖的细胞毒性）效应，是开发以信号阻断、调控或中和作用为主要机制的抗体药物的理想选择，可比IgG1产生更小的副反应。目前已有Pembrolizumab（曾用名Lambrolizumab）、Nivolumab两个抗PD-1的IgG4亚型抗体药先后于2014、2015年被美国FDA批准上市，还有Reslizumab（抗IL-5）、Lebrikizumab（抗IL-13）、Ixekizumab（抗IL-17a）等IgG4亚型抗体药已经提交新药上市申请或正在进行II、III期临床研究。IgG4亚型抗体药种类不断增多，正在医药领域发挥着越来越大的作用。

然而IgG4亚型的抗体药在纯化工艺上产生了新的问题。低pH病毒灭活是抗体药生产过程中的一个常规步骤，这一步骤一般是在ProteinA亲和层析之后，通过用pH3.3-3.8的低pH缓冲液将抗体从层析介质上洗脱来完成病毒灭活。与IgG1相比，IgG4亚型抗体在低pH条件下更容易发生聚集（aggregation），IgG4聚集物的比例可达纯化总产物的30%，并且这种聚集倾向主要由Fc段在低pH下的不稳定（熔解温度Tm值和熔融热ΔH降低）和解折叠（unfolding）构象变化引起，尤其是Fc段上的CH2区（Pharmaceutical Research 2016,Vol33, Issue 3: 716-728；J Pharm Sci 2014，103:1701-1710、115-127；J Mol Biol2014，426:630-44；Journal of Chromatography A 2015，1415:83-90）。低pH下的聚集倾向是IgG4亚型抗体的共性。

抗体形成聚集物不仅将降低抗体的活性，还可能形成免疫原性并导致药物副反应，对抗体聚集物的控制和检测是药品相关法规的要求。聚集物的出现会大幅降低抗体的纯化得率，因此解决抗体聚集的问题十分必要。

精氨酸、组氨酸等碱性氨基酸和蔗糖被报道能够预防抗体在纯化过程中的聚集，然而本单位研究发现碱性氨基酸和蔗糖等对预防IgG4亚型抗体聚集的效果并不理想，甚至还有反作用。因此需要开发一种新的防止IgG4抗体在低pH下聚集的方法。

发明内容

本发明解决的问题是IgG4亚型抗体在低pH条件下发生聚集的问题。本发明提供了一种纯化抗体的方法及所用缓冲液，能够将IgG4亚型抗体（包括含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白）在低pH下的聚集大幅降低，从而提高IgG4亚型抗体的纯化得率以及抗体药的活性和安全性。

本发明的技术方案如下：

一种纯化抗体的方法，所述的抗体是IgG4亚型，或是含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白，包含在低pH处理的过程中使用甘露醇的步骤。

在一些实施例中，所述的甘露醇的工作浓度为5-15%（w/v）。优选的，所述的甘露醇的工作浓度为10%（w/v）。

一种纯化抗体的方法，包含如下步骤：先采用纯化介质捕获IgG4亚型的抗体或含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白，再采用含有5-15%（w/v）甘露醇的低pH缓冲液将抗体从纯化介质上洗脱，然后进入后续的纯化或制剂步骤。