[发明专利]一种用于检测口蹄疫病毒A型的引物、试剂盒、使用方法及其应用

权利要求书

1.一种用于检测口蹄疫病毒A型的引物，其特征在于，所述的引物为引物 对FMDA，其中，

上游引物FMDAF：5′-ACACCCTGAGGGATATT-3′

下游引物FMDAR：5′-CATACCGTACAAATGGG-3′。

2.一种用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包 括引物对FMDA，其中，

上游引物FMDAF：5′-ACACCCTGAGGGATATT-3′

下游引物FMDAR：5′-CATACCGTACAAATGGG-3′。

3.根据权利要求2所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒，其特征在于， 所述的试剂盒还包括5×RTBuffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制剂、反转录酶、 超纯水、裂解液和冲洗液。

4.根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒，其特征在于， 所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

5.根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒，其特征在于， 所述的裂解液的组分为：羟基喹啉3～5％(质量分数)、磷酸三氯乙酯3.2～5.2μM、 异硫氰酸苯酯1.5～3.5μM、聚乙烯基吡咯烷酮1.3～3.5％(质量分数)、氯化钠 0.3～0.5M和柠檬酸钠0.6～0.9M。

6.根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒，其特征在于， 所述的冲洗液的组分为：三羟甲基氨基甲烷10μM，乙二胺四乙酸1μM，乙醇 60～80％(体积分数)；pH7.0。

7.一种如权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒的使用方法， 其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品的采集

(2)样品RNA的提取

(3)RT-PCR

对样品RNA进行RT-PCR扩增，反应体系25μl：5×RTBuffer5μl、12.5μM dNTPs5μl、125μM上游引物FMDAF和125μM下游引物FMDAR各2μl、25U/μl Taq酶0.5μl、2.5U/μlRNA酶抑制剂1μl、2.5μM反转录酶1μl、超纯水3.5μl和 5ng/μlRNA5μl；

RT-PCR扩增程序为：50℃30min，94℃2min；94℃35s，55℃45s，72℃35s， 共30个循环；72℃2min；

(4)RT-PCR扩增产物的检测

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果。

8.根据权利要求7所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒的使用方法， 其特征在于，所述的样品的采集分为固体状动物组织的采集或液体状动物组织 的采集；其中，

固体状动物组织的采集方法为：无菌采集动物组织病料0.1-100mg，装入无 RNA酶污染的离心管中备用；

液体状动物组织的采集分为分泌液的采集或血液的采集，分泌液的采集方 法为：用鼻咽拭子采集鼻咽液，装入无RNA酶污染的离心管中备用；血液的采 集方法为：取全血、血清或血浆10-100μl，加入无RNA酶污染的离心管中备用。

9.根据权利要求8所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒的使用方法， 其特征在于，所述的样品RNA的提取，具体方法为：

(1)将固体状的动物组织先进行研磨处理，液体状的动物组织直接用于提 取；

(2)在研磨后成糊状的动物组织20-100mg或液体状动物组织20-100μl中， 加裂解液500μl，12000rpm离心30s，分离出上清液；

(3)将上清液转入离心管中，加无水乙醇500μl，分次转到RNA纯化柱上， 12000rpm离心30s，得到粗提的RNA；

(4)用冲洗液500μl冲洗RNA纯化柱，12000rpm离心30s；

(5)将RNA纯化柱转到另一离心管，加超纯水50μl，12000rpm离心30s， 得到病毒及组织基因组的RNA，于-20℃保存备用。

10.一种如权利要求2-6任一项所述的用于检测口蹄疫病毒A型的试剂盒 在检测口蹄疫病毒A型方面的应用。