[发明专利]一种基于dacB提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程与发酵工程领域，具体涉及一种基于dacB提高大肠杆菌重组 蛋白胞外分泌水平的方法及其应用。

技术背景

大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的重组蛋白表达系统，有操作简单、 成本低廉等优点，可以快速大规模地生产目的蛋白，但是在大肠杆菌的异源表达中，大部分 重组蛋白在信号肽的引导下分泌到周质空间，会导致中间体大量积聚，对蛋白质的生产造 成阻碍。

肽聚糖是由双糖单位，四肽尾还有肽桥聚合而成得多层网状大分子结构。肽聚糖 层的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1,4糖苷键连接而成，糖链间由肽链交 联，构成稳定的网状结构，这样构成了整个细菌表面的细胞壁。作为细胞壁的主要成分，肽 聚糖的组成与细胞结构的完整性、外膜的通透性的维持、细菌的抗干燥能力和耐热性等均 密切相关。dacB基因表达的D，D-羧肽酶能够从肽聚糖五肽上移除最后一个末端D-Ala，导致 转肽反应中供体不可用，可以控制肽聚糖的网状交联水平，从而改变细胞的通透性。

发明内容

本发明提供一种基于dacB提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法。

为实现上述目的，本发明涉及的技术方案包括以下步骤：

1)羧肽酶重组质粒的构建：PCR扩增D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacB，然后用 限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，质粒pRSFDuet也用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶 切，胶回收纯化后，采用DNA连接酶将基因片段连接至酶切后质粒pRSFDuet上，获得重组质 粒pRSFDuet-dacB。

2)转化：将重组质粒pRSFDuet-dacB转化到含有淀粉酶重组质粒pETDuet-AmyK的 E.coliBL21(DE3)中。

3)诱导表达：接单菌落于LB液体培养基过夜培养，然后按1％的接种量转接TB液体 培养基，37℃培养，加入IPTG，25℃诱导。

本发明中所用到的材料和方法：

1)培养基

LB固体培养基：15g/L琼脂，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取粉，10g/LNaCl，pH 7.0。

LB液体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取粉，10g/LNaCl，pH7.0。

TB液体培养基：12g/L胰蛋白胨，24g酵母提取粉，甘油4mL，2.31gKH₂PO₄

12.54gK₂HPO₄，pH7.5，定容到1L。

2)培养方法

种子培养：将平板划线长出的单菌落接到LB液体培养基中，培养转速200r/min，在 37℃下恒温摇床培养8h。

发酵培养：按1％(v/v)的接种量，将液体种子接种到发酵培养基TB中，发酵培养基 的装液量为250mL三角瓶中装入30mL培养基，转速200r/min，37℃培养，加入IPTG，25℃下恒 温摇床培养。

3)分析方法

生物量测定：测定600nm下的吸光光度值。

淀粉酶活性测定：采用采用DNS氧化还原法测定。

附图说明

图1pRSFDuet-dacB双酶切验证电泳图。

图2羧肽酶dacB过量表达对E.coli胞外分泌重组淀粉酶的影响。

图3羧肽酶过量表达对淀粉酶胞内外分布的影响。

图4羧肽酶过量表达对胞内可溶性肽聚糖的影响。

具体实施方式

实施例1本实施例说明过量表达dacB对E.coli胞外分泌重组淀粉酶的影响

将构建成功的重组质粒pRSFDuet-dacB双酶切验证后(图1)，转化到含有淀粉酶重 组质粒

pETDuet-AmyK的E.coliBL21(DE3)中后，诱导发酵24h时，过量表达羧肽酶dacB的 E.coli胞外分泌重组淀粉酶的水平显著提高，胞外淀粉酶酶活力达到16.89U/mL(图2)。但 没有过量表达任何羧肽酶的对照菌株诱导发酵24h后，在E.coli胞外测得的重组淀粉酶的 酶活力仅为1.74U/mL。

实施例2本实施例说明过量表达dacB对重组淀粉酶在E.coli胞内外分布的影响