[发明专利]一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用。

背景技术

全球面临的能源问题、环境问题向人们提出了发展可再生清洁能源化学品的要求。乳酸是生产聚乳酸的单体。聚乳酸是理想的绿色高分子材料，可完全生物降解，具有良好的机械性能、物理特性、生物相容性及防腐、耐菌性等优点，是其它生物降解材料所无法比拟的。聚乳酸是传统塑料制品的理想替代品，可应用于各行各业，如生产生物可降解塑料及人工合成生物组织等。全球每年对塑料的需求量是200亿公斤，而聚乳酸的产量只有450万公斤。由此可见全球对生产聚乳酸的原料乳酸的需求。

乳酸又称2-羟基丙酸。因分子中有一个不对称碳原子，而具有旋光性。因此乳酸有L-乳酸和D-乳酸两种旋光异构体。不同光学性质的乳酸用途不同。聚乳酸的性能与D-乳酸的含量相关，因此D-乳酸是生产优质聚乳酸所必须的。由此可见生产光学纯D-乳酸的重要性及必要性。

乳酸的生产方法有发酵法、化学合成法和酶转化法。发酵法主要是以粮食为原料，由乳酸菌对粮食淀粉发酵生产乳酸。化学发和酶法是以能源化学品为原料，具有污染环境的弊端。上述方法主要用于生产L-乳酸或消旋乳酸LD-乳酸，而对光学纯D-乳酸的生产是随着聚乳酸的广泛应用而兴起的。为减缓能源短缺及避免污染环境，近年来科研人员尝试通过代谢工程改造细菌用发酵法生产光学纯乳酸。

乳酸脱氢酶是生物合成乳酸的关键酶，通过把丙酮酸还原来合成乳酸。乳酸脱氢酶(L-LDH)根据其辅因子偏好性分为NADH依赖型和NADPH依赖型，而天然的乳酸脱氢酶多为NADH依赖型。通常异养菌中辅因子以NADH为主，而光合自养菌(如蓝藻)中辅因子以NADPH为主，因子乳酸脱氢酶的辅因子选择性限制了生物合成乳酸的宿主选择范围。此外，乳酸脱氢酶根据其催化的产物不同分为L-乳酸脱氢酶(L-LDH)和D-乳酸脱氢酶(D-LDH)两种，天然的乳酸脱氢酶多是L型的。因此，为了满足生物合成光学纯D-乳酸的需求，对现有D-乳酸脱氢酶进行改造是非常必要的，提高D-乳酸脱氢酶活性，同时拓宽其辅因子选择性，使其可以同时高效利用NADH和NADPH两种辅因子，不仅可以提高催化效率，还可以避免生物合成乳酸的宿主只能选择以NADH为主的异养菌的局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用。

本发明提供了一种蛋白质，是在现有蛋白质的基础上进行定点突变得到的，命名为D-LDH*蛋白，是如下(a1)至(a6)中的任一种：

(a1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乳酸脱氢酶活性的由序列3衍生的蛋白质；

(a3)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脱氢酶活性的由序列3衍生的蛋白质；

(a4)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a5)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乳酸脱氢酶活性的由序列7衍生的蛋白质；

(a6)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脱氢酶活性的由序列7衍生的蛋白质。

编码所述D-LDH*蛋白的基因(命名为D-ldh*基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因为如下(b1)至(b10)中的任一种：

(b1)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码乳酸脱氢酶的DNA分子；

(b3)与(b1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码乳酸脱氢酶的DNA分子；

(b4)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码D-乳酸脱氢酶的DNA分子；

(b5)与(b1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码D-乳酸脱氢酶的DNA分子；

(b6)编码区如序列表中序列8所示的DNA分子；

(b7)在严格条件下与(b6)限定的DNA序列杂交且编码乳酸脱氢酶的DNA分子；

(b8)与(b6)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码乳酸脱氢酶的DNA分子；